陈 一

[摘要] 本文旨在研究在将间质干细胞(MSC)移植于人类羊膜(HAM)后,注入损伤兔体全皮的条件下兔体全皮损伤的修复效果。4组兔体的全皮有大致相同的五个缺损伤口,它们分别被不同的药剂处理,其中:A组被融合自体同源MSC的HAM所处理;B组被融合异体同种MSC的HAM所处理;C组被HAM所处理,同时注射自体同源的MSC;D组被HAM所处理,同时注射异体同种的MSC。

在药剂注入的7、12及15天后,每个兔体小组内兔皮伤口的大小均有所测量及记录。一般情况下,药剂注入25天后几个小组兔皮伤口均陆续愈合。用苏木精与曙红对创口染色并在显微镜下观察,染色区可观察到表皮与真皮层颗粒状组织数量及其他特征。

其中,A、B两组在药剂注入术后的7、12、15天后伤口愈合相关数据方面进展明显,在皮肤伤口修复方面表现出最为显著的效果。且A、B两组数据没有统计学上显著的差异。

对A、B两组进行组织学水平检查,发现成熟分化的薄层表皮,以及附着沉积胶原蛋白束的真皮层皮肤组织附件,附件完全恢复;C、D两组为不成熟分泌薄壁细胞的致密表皮,真皮层皮肤成纤维细胞不断增殖,附件不完全恢复。因此,填充MSC的HAM的注入对于兔皮组织缺损修复起着重要作用,而自体同源MSC与异体同种MSC的植入对于伤口的愈合情况没有显著的效果差异。

[关键词]羊膜组织 间质干细胞 组织工程移植皮肤组织缺损修复

简介

本实验选用骨髓干细胞与羊膜组织融合体修复缺损的皮肤组织,探讨的主要问题是:一、人类羊膜(HAM)与骨髓干细胞(MSC)融合后注入的修复效果与HAM、MSC分别注入的修复效果比较;二、异体同种干细胞与自体同源干细胞在修复过程中的效果比较。

在最近的研究中,异体同种间质干细胞(MSC)被证明在促进伤口愈合方面作用显著,无论是单独注入皮肤伤口处还是与人类羊膜(HAM)融合后注入伤口处。本研究旨在调查将MSC与HAM融合后植入兔全皮损伤处对伤口愈合的影响。

一、实验材料与具体方法

1.取材动物:健康白兔。数量:21只;年龄:15周左右;体重:2-2.5千克。

2.分配方式:其中一只用于异体同种干细胞的取材;另外20只被随机平均分配到A、B、C、D四组中。每组白兔均在相同环境中喂养,食物与水的份量均按标准给予。

3.人类羊膜(HAM)的准备:提取胎盘材料,在含抗生素的无菌环溶液中浸泡清除血渍。将羊膜小心剥离,用无菌环溶液漂洗,上皮朝上放置于硝化纤维纸上于-80℃环境中保存。使用前取出,于37℃环境中放置30分钟,剥离硝化纤维膜,上皮朝上置于载玻片。将羊膜于37℃0.25%胰岛素-乙二胺四乙酸中浸泡30分钟后用磷酸缓冲盐溶液冲洗。

4.间质干细胞(MSC)的隔离培养:自体同源间质干细胞通过穿刺实验组中白兔股骨末端而取得;异体同种间质干细胞则取自未被分进组内的白兔,无菌条件下取得。提取骨髓2ml,置于含肝磷脂的无菌试管内。于萃取液中分层筛选出红血球,将浮于表层的血浆倒掉。将骨髓样品倒入1.077g/ml Ficoll-Hypaque溶液中,在室温下以1000r/min的速度离心20分钟。随后可用10%胎儿血清和抗生素(100IU/ml青霉素,100μg/ml链霉素)在底部溶液中央及溶液界面处提取干细胞,并以106个/ml的细胞密度将其转移到组织培养瓶内。培养瓶置于培养箱内,周围气体环境潮湿(5%CO2,95%空气,37℃)。48小时后第一次换气,之后每2-3天换一次。原始培养大约持续7-10天,在此期间,非粘附性的造血细胞碎片被遗弃。培养细胞分裂一定次数后注入0.25%胰岛素溶液与0.02%乙二胺四乙酸溶液使之传代2-3次。

5.间质干细胞(MSC)在人类羊膜(HAM)表面的转染与填充:转染细胞在使用前于37℃,5%CO2环境下在全能补给性培养基上放置4小时。随后用CD45,73,105, 166流式细胞计测间质干细胞的显型与纯度。将细胞活素基因(干细胞因子)转染至曾活体传代的间质干细胞中,并对细胞标记上绿色荧光蛋白质后融合进羊膜,荧光镜检确保转染成功。流式细胞计分析结果表明传代间质干细胞的纯度约为85%-97%。

在羊膜组织表面用播种环划下填充间质干细胞(MSC)的范围。转染前3小时抽离MSC介质并置换新鲜培养基。使用磷酸钙对细胞进行转染。在无菌试管内加入DNA、氯化钙以及足量的蒸馏水,另一试管内加入额定数量的缓冲盐溶液。将无菌试管内溶液倒入缓冲液,一边倒入一边摇匀,倒毕后于室温放置30分钟后继续摇匀。最后,将溶液倒至HAM所在的培养皿上,轻轻摇晃使之在HAM表面分布均衡。随后立即用冷冻纤维蛋白黏合剂将间质干细胞(MSC)融合入羊膜组织内并在37℃,5%CO2环境下结合。48小时后进行荧光镜检,确保MSC与HAM充分融合。

6.实验操作具体过程:20只白兔被随机均分成4组,在无菌室内用消毒手术器械在每只白兔背部划下位置、面积与深度基本相同的伤口,并在伤口处各取1.5cm×1.5cm的全皮组织。依组别差异,伤口上均匀涂抹相应的HAM试剂并缝合伤口。A组5只白兔的伤口涂上融合自体同源MSC的HAM,B组5只白兔的伤口涂上融合异体同种MSC的HAM,细胞个数大约为2×105(融合液2ml);C组5只白兔的全皮组织伤口涂上HAM,随后注入自体同源MSC,D组5只白兔的全皮组织伤口涂上HAM,随后注入异体同种MSC,MSC溶液0.5ml。为防止羊膜脱落脱水,伤口采用标准湿敷后将白兔放进笼中,避免伤口感染。

7.创口尺寸测量与组织学评估:使白兔呈标准卧姿,对伤口情况进行拍摄并测量伤口尺寸。移植15天后,伤口基本结痂;在移植手术进行7天、12天及15天后对肉眼可见的伤口尺寸进行测量。伤口大多在移植手术后25天完全愈合。痊愈的损伤区域上可见一道正常组织的模糊界线(10mm长,10mm宽,5mm深),将损伤分为两部分。将组织浸入10%福尔马林液,并牢牢嵌入石蜡中封装。被苏木精及曙红染色的区域可在显微镜下观测到表皮与真皮层颗粒状组织的数量,从而可精确评估伤口愈合质量。

二、实验结果

1.取材动物:25天后,所有白兔皮肤伤口已经完全痊愈,表皮开始再生。

2.创口尺寸测量:A、B两组在移植手术后7天、12天和15天在伤口愈合方面表现出统计学上明显的好转特征,因而在修复缺损上效果明显。第7天,A组与B组伤口愈合程度分别为45.3±7.2%与43.7±2.8%,而C组与D组伤口愈合程度分别为16.2±4.9%与14.3±6.7%。A组在伤口愈合比率上有轻微高于B组的趋势,但无明显数字特征表明两者在促进伤口愈合能力方面的大小区别。

3.组织学评估: 25天后,A组材料组织的表皮与真皮层都恢复良好。表皮较薄,细胞分化成熟,真皮可见不断分裂的成纤维细胞。此外存在较轻炎症反应,血管分布轻微扩张。D组亦可见中心增稠的表皮,真皮纤维化广泛分布;毛细血管形成,成纤维细胞加速分裂,存在轻微炎症反应。C、D两组皮肤附件亦有部分恢复。

4.实验结论:异体同种HAM被用于一系列外科手术中,或治愈疾病,或代替坏死组织,或用于皮肤、眼角膜、眼球结膜的慢性伤口包扎。虽然羊膜有很多利于组织缺损修复的结构特点,例如免疫特性、抗菌效果,以及在应用中减缓痛苦的效力等等,但它却并不一定适宜于临床应用。羊膜的免疫特性具有位点专一性,它也被广泛应用于眼科治疗,例如眼角膜---另一个具免疫特性的位点。异体同种羊膜组织也有其他方面的应用,但免疫识别和应答的概率依然保持不变。就目前而言,羊膜以及其细胞因其较低的免疫原特性而能成为理想的移植组织。

MSC是具有多重效果的细胞,且可根据生长转化因子系不同组分的活动分为不同种类的细胞。初步临床实验结果表明,MSC的自身移植术可能改善心肌梗死的心脏功能。干细胞的成形或分化转移过程始终是发展生物学、细胞生物学以及干细胞生物学等领域研究的核心部分。MSC现则是广泛应用的用于修复和再生的细胞来源。虽然干细胞有着正面作用的治疗潜力,但临床应用对其而言依然需面临诸多挑战。毋庸置疑,细胞移植的小环境对于MSC皮肤附件的定位与成型起着至关重要的作用。

研究结果表明,间质干细胞(MSC)在与羊膜组织(HAM)融合后注入全皮组织,修复损伤的效果较为明显;分别注射间质干细胞与羊膜组织后的全皮组织伤口愈合情况远较前者迟缓,但全皮组织在移植干细胞后出现不明干细胞特性。干细胞的作用机理还需要深层次的实验探究,探究对象包括干细胞末期分化形式以及在非造血组织中的干细胞可塑性。

总而言之,在兔全皮组织损伤修复的过程中,羊膜组织的融合对于骨髓干细胞移植的修复皮肤组织缺损效果有极强的推动作用。其中,自体同源干细胞与异体同种干细胞融合移植效果上无明显区别,均具有较强的修复缺损能力和促进再生能力。

参考文献:

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[4] Badiavas EV, Abedi M, Butmarc J, Falanga V, Quesenberry P (2003) Participation of bone marrow derived cells in cutaneous wound healing. J Cell Physiol 196:245–250

作者简介:

陈一(1990-),女,重庆市人,在读学士,主要研究方向:生物材料与组织工程。