徐贵江 张 明 任丽伟 洪菊生 李国庆

1 扬州市妇幼保健医院（225002）

2 扬州大学动物科学与技术学院（225002）

目前，基因疗法在医学领域掀起了研究热潮。然而，实施基因治疗的前提是将功能基因导入需要接受治疗的靶器官或靶组织的细胞中，让功能基因表达产生能够消除或减轻疾病症状的物质。

对此，基因转染研究就显得尤为重要。基因转染方法众多，如磷酸钙法、电穿孔法、阳离子脂质体法、病毒介导法和显微注射法等。不同的转染方法、不同的细胞系转染效率不尽相同。本研究采用EGFP报告基因转染AAV-293、NIH-3T3、CEF 3种细胞，旨在比较3种细胞用于基因转染时效率的高低。

1 材料与方法

1.1 实验材料

E.coliDH5a菌株、pEGFP-C1质粒、鸡胚成纤维细胞（CEF）均由扬州大学动物科学与技术学院分子实验室提供；AAV-293和NIH-3T3细胞株为作者医院保存。

1.2 主要仪器和设备

超净台；CO2培养箱；荧光倒置显微镜；电子天平；离心机；水浴锅，电热恒温板等。

1.3 主要试剂

高糖DMEM培养液、胰蛋白酶、聚乙烯亚胺（PEI）购自 Sigma公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；质粒小量抽提试剂盒购自（大连）Takara 公司。

1.4 质粒的小量抽提

将含有质粒pEGFP-N1的E.coliDH5а培养过夜，次日使用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒pEGFP-N1。

1.5 质粒的纯化与消毒

将抽提的质粒pEGFP-N1进行去内毒素纯化处理，用2倍体积的无水乙醇沉淀提取质粒，具体方法步骤见参考文献[1]。75%乙醇洗涤质粒沉淀进行灭菌处理，在无菌条件下晾干后，溶解于5%葡萄糖溶液中。

1.6 质粒的浓度及纯度测定

使用核酸浓度及纯度分析仪测定纯化的质粒pEGFP-N1。……