张虎刚，张志翔，万端极，*

（1.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，内蒙古呼和浩特011500；2.湖北工业大学膜技术研究所，湖北武汉430068）

酪蛋白酶解制活性肽的工艺条件

张虎刚1，张志翔2，万端极2，*

（1.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，内蒙古呼和浩特011500；2.湖北工业大学膜技术研究所，湖北武汉430068）

选用胰蛋白酶水解牛乳酪蛋白制备活性肽。以水解度（DH），水解速度，水解时间（t）和分子量分布为指标，探讨对酶的底料浓度（E/S），底物浓度比（S），水解温度（T），水解时间（t），4个因数对酶解效果的影响，确定最佳条件组合：水解温度40℃，底物浓度：6%，酶底物浓度比：2%，水解时间：120 min。

酪蛋白；pH值；酶；底物浓度；温度；时间

Abstract:This experiment choice pancreas enzyme to preparation bioactive peptides.Use Hydrolysis Degree,Hydrolysis rate,t,U distribution four point to experiment,choice best factor about substrate,substrate consentration,temperature,time of hydrolysis.Find best design：temperature：40,Substrate concentration：6%,enzyme consentration：2%,pH：7,hydrolysis time：120 min.

Key words：casein；pH；enzyme；substrate concentration；temperature；time

牛乳中蛋白质含量为牛乳的3%～3.5%，主要包括酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、乳铁蛋白和一些具重要生理功能的酶类，其中酪蛋白占蛋白总量的78.8%。在酪蛋白中有4种主要形式,分别是αS-1酪蛋白，αS-2酪蛋白，β酪蛋白，γ酪蛋白。水解酪蛋白的酶类也有很多，本文重点研究一种动物来源的蛋白水解酶—胰蛋白酶。胰蛋白酶专一作用于精氨酸、赖氨酸的羧基形成的肽键酪蛋白具有较强的水解度[1]。研究表明，当分子量处于5000 u～10000 u时候的蛋白肽具有很强的生物活性[2]。因为在此前的试验中通过高效液相色谱得出：当水解度在20%～25%之间时，分子量主要分布在5000 u～10000 u左右。因此我们的目标是找出适当的水解条件将水解度控制在20%～25%之间。

1 材料与检测方法

1.1 材料与仪器

酪蛋白：为试剂干酪素，经半自动凯氏定氮仪测定含氮量为13.12%，由湖北工业大学生物工程学院提供；胰蛋白酶：上海伯奥生物科技有限公司；HCl，NaOH等其他试剂均为分析纯；HD-3紫外检测仪，HI-2恒流泵上海沪西分仪器厂；ZD-2型pH计上海雷磁仪器厂；78HW-型恒温磁力搅拌器江苏省金坛市医疗仪器厂；entrifuge 5810R离心机，美国产。

1.2 可溶性氮的测定（微量扩散法）

取乳酪蛋白肽溶液5 mL，加入1 g消化催化剂和10 mL浓硫酸，消化至黄绿色，取出冷却至室温，加水定容。然后取5 mL加入到扩散皿外室，并在扩散皿内室加入2 mL 2%硼酸溶液，再向外室加入4 mL 40%浓NaOH溶液，并迅速盖上玻片。在室温条件下放置24 h后，用标准的盐酸溶液滴定硼酸溶液至紫罗兰色。

式中：V1为空白所需标准酸体积，mL；V2为滴定待测液所需标准酸体积，mL；NH为标准酸溶液当量浓度；0.014=1 mL当量氮的克数。

1.3 水解度的测定一TCA法

10 mL酶解物中加入10 mL TCA，在水浴中加热30 min，然后在4000 r/min离心15 min。取上清液，蛋白质总氮和上清液可溶性氮由2.1中方法计算。

式中：N1为空白试样的含氮量，%；N2为乳酪蛋白的含氮量，%；N3为TCA处理后酶解液的含氮量，%。

1.4 水解速度的测定

水解速度=水解度/单位时间（g/min）。

2 试验方法

2.1 酶浓度对水解度的影响[3]

酶浓度对水解度的影响，见图1。

由图1可以看出水解度随酶浓度的增加而加大，但是不完全是按照呈线性关系递增。水解前20 min，在几种酶浓度条件下，水解度几乎都是按照线性关系增加[4]。随着时间增长，酶浓度高的水解度增加较快，但是不太明显，由图1可以看出酶浓度在2.0 g/L时，水解度随时间增长最为明显。因此，酶浓度选用2.0 g/L比较适合。

2.2 底物浓度，水解时间对水解度的影响

试验采用底物浓度为2%，但是考虑工业化生产和其经济效益，决定在试验中适当的加大底物浓度，试图找到合适的底物浓度比，结果见图2。

由图2可知，在反应0.5 h后底物浓度6%~8%的曲线几乎重合，7%、8%的水解度比6%几乎没有明显差别，而5%和曲线可以和6%的区分开，所以，底物浓度选用6%比较适合。同时认为7%~8%产生底物抑制[5]。

从图2还可以看出当时间为2 h时，水解度几乎达到最大值，2 h以后的水解度几乎没有增加。因此，将水解时间定为2 h是合适的。

2.3 底物浓度与反应速度的关系

底物浓度与反应速度的关系，见图3。

图3说明了胰蛋白酶的水解体系中底物浓度与水解速度的关系，从中可以看出当底物浓度大于6%时候，体系出现了底物抑制现象[6]；所以把底物浓度定为 6%是合适的。在水解的 10、20、30、60、120 min的五个时间段都可以看出当底物浓度大于6%时，水解速度几乎都出现了下降趋势。由此可见由于底物浓度达到一定时，底物分子的分布过于密集，不能和酶进行有效接触，这样它们就不能完全的接受酶的催化位点[7]，从而表现为高底物抑制。

2.4 水解温度与水解度关系

水解温度与水解度关系，见图4。

由图4可见，从30℃开始，随着温度升高，水解度也加大[8]，在达到35℃时候趋于平缓，在40℃时水解度达到最大，然后水解度开始下降，45℃后下降幅度加大。因此，本试验将适合的水解温度定为40℃。

2.5 pH值与水解度关系

在底物浓度为5%，酶浓度为2%，温度40℃条件下，选用不同的pH值，分别酶解2 h，然后测定其水解度见图5。

溶液的酸碱度对胰蛋白酶的酶活性影响较大，一旦酸性或碱性过大，都会抑制甚至灭去胰木瓜蛋白酶的活性[9]。当溶液pH值在中性或偏弱酸弱碱条件，胰蛋白酶对乳酪蛋白有较高的水解度，由此可以看出胰蛋白酶是一种中性酶。因此，选用pH=7较为适宜。

3 多因素对水解度的效果

多因素对水解度的效果见表1。

表1 多因素对水解度的效果Table 1 Multifactorial experiment impact on DH

由统计分析表1可知，酶解温度，酶解时间，酶用量，底物浓度4个因素中，酶浓度对水解度影响最大，温度和底物浓度次之，反应时间影响最小。而且还可以从图中看出，当选用方案6时，效果最好。即温度为40℃，时间120 min，酶浓度2%，底物浓度6%时最好。

4 结论

1）蛋白质类底物的水解与小分子类的底物的水解是不同的。并不是底物浓度越高越好，当浓度达到一定时，随着底物浓度的增加水解度不会增加。当底物浓度过高时，黏度增加，水解液中的酪蛋白不能和酶完全有效的接触，造成水解速度下降。

2）由多因素正交试验可得：酶浓度对水解度影响最大，温度和底物浓度次之，反应时间影响最小。

3）酶的浓度与水解度是成正比的，但是酶浓度达到2%后，随着酶浓度的增加水解度增加不多，所以从经济角度看2%的酶浓度是适合此反应的。

4）根据本研究结果可知：胰蛋白酶水解酪蛋白的最佳底物浓度为6%，而胰蛋白酶浓度为2%，水解温度为40℃，水解时间2 h，pH值为7。

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Casein Solution Process Conditions of Active Peptide Research

ZHANG Hu-gang1,ZHANG Zhi-xiang2,WAN Duan-ji2,*
（1.Inner Mongolia Mengniu Dairy（Group）Co.,Ltd,Hohhot 011500，Inner Mongolia,China；2.Institute of Membrane Technology of Hubei University of Technology,Wuhan 430068，Hubei,China）

2010-02-01

张虎刚（1975—），男（汉），高级工程师，硕士，研究方向：食品加工工艺。

*通信作者：万端极（1953—），男，教授。