高效液相色谱法测定食品中非食用色素

2010-09-12王荣艳贾丽范筱京

食品研究与开发 2010年11期

关键词：鸡心无水乙醇碱性

王荣艳，贾丽，范筱京

（北京市理化分析测试中心，北京100089）

高效液相色谱法测定食品中非食用色素

王荣艳，贾丽，范筱京

（北京市理化分析测试中心，北京100089）

建立食品中的酸性橙Ⅱ、碱性橙2和碱性嫩黄O染料残留的高效液相色谱同时测定的方法，样品通过提取之后，采用基质固相分散法净化，然后分别用乙醇和乙醇-氨水-水（7∶2∶1）分步洗脱，最后进行HPLC分离、检测。此方法的回收率平均为79%，酸性橙Ⅱ的检出限为0.01 mg/kg、碱性橙2的检出限为0.02 mg/kg，碱性嫩黄O染料的检出限为0.01 mg/kg，相对标准偏差平均为3.53%。

酸性橙Ⅱ；碱性橙2；碱性嫩黄O；基质固相分散；高效液相色谱法

Abstract：This paper described a newly developed High Performance Liquid Chromatography （HPLC）method for simultaneous determination of acid orangeⅡ、basic orange 2 and basic flavine O in foods.Samples were extracted,cleaner up through Matrix solid phase dispersion（MSPD）.The three forbidden food pigments were eluted by ethanol and ethanol-ammonia-water（7∶2∶1）respectively,and separation and detection by HPLC.The recoveries of methanol were 79%,the detection limit of acid orangeⅡ，basic orange 2 and basic flavine O was 0.01 mg/kg，0.02 mg/kg and 0.01 mg/kg separately.The relative standard deviation of this method was 3.53%.

Key words：acid orangeⅡ；basic orange 2；basic flavine O；Matrix Solid Phase Dispersion (MSPD)；High Performance Liquid Chromatography（HPLC）

酸性橙Ⅱ、碱性橙2和碱性嫩黄O均为工业染料，用于染丝、麻、皮革等，这3种物质均可以使人致癌，根据GB2760-2007《食品添加剂使用卫生标准》规定，这3种物质严禁作为食品使用。但不法商贩利用其颜色鲜艳、着色稳定、价廉的特点非法添加于豆制品中，使腐竹、豆皮的色泽光亮，欺骗消费者，严重危害了广大消费者的身体健康[1]。目前，酸性橙Ⅱ、碱性橙2和碱性嫩黄O的检测方法有高效液相色谱法[2-4]，以及DB33/T 703-2008《食品和农产品中多种碱性工业染料的测定液相色谱-串联质谱法》中采用液相色谱—质谱联用检测碱性橙和碱性嫩黄O，尚未检索到同时检测酸性橙Ⅱ、碱性橙2和碱性嫩黄O的相关文献，初步建立了用高效液相色谱法同时测定以上3种物质的方法，该方法能快速、准确、简便的检出酸性橙Ⅱ、碱性橙2和碱性嫩黄O，可以满足食品检验的需要。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

HPLC系统配2998二极管阵列检测器（Waters 2695）；高速冷冻离心机（SIGMA 4K15）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂RE52CS）；固相萃取装置（Agela）。

甲醇、无水乙醇（色谱纯）；无水硫酸钠（分析纯）；冰乙酸（分析纯）；甲酸（分析纯）；氨水（分析纯）；高纯水；酸性橙Ⅱ、碱性橙2和碱性嫩黄O标准品（优级纯）。

标准溶液配制：准确称取10.0 mg碱性橙Ⅱ、碱性橙2和碱性嫩黄O标准品，用甲醇溶解并准确定容到10 mL容量瓶，制成标准贮备液。准确移取标准溶液适量，用甲醇稀释制成系列标准混合溶液。

1.2 样品处理方法

1.2.1 提取

称取10.0 g粉碎均匀的豆制品，置于50 mL离心管中，加入3 g无水硫酸钠和15 mL无水乙醇，摇匀，超声提取30 min，然后以5000 r/min离心5 min，将上清液倒入鸡心瓶中。残渣再用无水乙醇提取2次，重复上述步骤，合并上清液于鸡心瓶中。将鸡心瓶置于旋转蒸发仪上50℃浓缩至近干。

1.2.2 净化

用20 mL高纯水溶解鸡心瓶中物质，加入1.5 g聚酰胺粉，混匀，60℃水浴放置30 min。将混合物置于底层垫有滤纸的10 mL注射器中制成萃取柱，如图1所示。

使其液滴均匀滴下（必要时，可以在固相萃取装置上操作），用10 mL无水乙醇洗脱，收集洗脱液Ⅰ于鸡心瓶中；然后分别用10 mL高纯水和10 mL甲醇/甲酸混合液（体积比6∶4）洗涤萃取柱，弃去洗涤液，再用无水乙醇/氨水/水混合液（体积比 7∶2∶1）洗脱，收集洗脱液Ⅱ于烧杯中。

1.2.3 浓缩定容

将盛有洗脱液Ⅰ的鸡心瓶置于旋转蒸发仪上50℃浓缩至近干，用甲醇溶解，并准确定容至2 mL；将盛有洗脱液Ⅱ的烧杯置于沸水浴中蒸至近干，用水溶解，并准确定容至2 mL。最后定容液过膜待测。

1.3 色谱分离条件

色谱柱：Agilent SB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱温：25℃；PDA检测器（波长范围：350 nm～550 nm）；进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min。流动相：甲醇：20 mmol/L乙酸铵溶液体积为65∶35。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件选择

由于酸性橙Ⅱ、碱性橙2和碱性嫩黄O 3种物质的pH值有所不同，所以同时检测3种物质时流动相选择不能具有酸碱性，通过试验发现采用20 mmol/L的乙酸铵和甲醇作为流动相，以及Agilent SB-C18，在等度条件下即可将3种物质很好的分开且峰形良好；用二极管阵列检测器扫描350 nm～550 nm，发现在450 nm时酸性橙Ⅱ、碱性橙2和碱性嫩黄O都有较好的峰形，如图2。

2.2 前处理条件的选择

由于乙醇具有较强的极性，酸性橙Ⅱ、碱性橙2和碱性嫩黄O都能很好的溶于乙醇，且其对环境的污染小，故选择乙醇作为提取液；由于聚酰胺粉具有较强的吸附性，所以采用其作为基质固相分散剂，这样染料会被聚酰胺粉吸附，减少食品中蛋白质、淀粉和脂肪等物质的干扰；由于酸性橙Ⅱ、碱性橙2和碱性嫩黄O的酸碱性不一样，所以在用聚酰胺吸附之后用2种洗脱剂分步洗脱，最后用HPLC检测，结果较好，如图3所示。

2.3 标准曲线和检出限

配制0.1 g/mL～20 g/mL的标准溶液，进样测定，以峰面积（y）对质量浓度（x，g/mL）作图，得到酸性橙Ⅱ、碱性橙2和碱性嫩黄O的线性方程。酸性橙Ⅱ的线性方程为y=26576x+653.19，R2=0.9997，碱性橙2的线性方程为y=42361x+538.92，R2=0.9997，碱性嫩黄O的线性方程为y=51301x-2851，R2=0.9997。以信噪比S/N为3时对应的目标物浓度确定检出限，得到本方法对豆制品中酸性橙Ⅱ、碱性橙2和碱性嫩黄O的检出限分别为 0.01、0.02、0.01 mg/kg。