大豆发芽过程中酶的含量变化及营养变化研究

2010-09-12李新华刘星波

食品工业科技 2010年10期

关键词：内源氧化酶蛋白酶

李新华，刘星波

（沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110161）

大豆发芽过程中酶的含量变化及营养变化研究

李新华，刘星波

（沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110161）

探讨大豆发芽过程中脂肪氧化酶、内源蛋白酶和游离氨基酸及部分营养物质的变化情况。采用不同发芽时间的发芽大豆进行脂肪氧化酶和内源蛋白酶含量的检测和分析。结果表明：沈农8号大豆中，脂肪氧化同功酶L-1的含量最高，在大豆发芽过程中，脂肪氧化酶的活性逐渐降低；内源蛋白酶和游离氨基酸的含量变化基本一致；脂肪含量降低；维生素C含量增高。

大豆发芽，脂肪氧化酶，内源蛋白酶，游离氨基酸，脂肪，维生素C

Abstract：The changes of lipoxygenase，endogenous protease，free amino acids and some changes in nutrients during the processing of soybean germination were studied through different germination time.The results showed that Shennong 8，soybeans，lipoxygenase isoenzymes L-1 content were the highest.In soybean germination processing，lipoxygenase activity gradually reduced，endogenous protease and free amino acid content were basically the same，fat content lowered，∨itamin C content increased.

Key words：soybean sprout；lipoxygenase；endogenous protease；free amino acids；fat；∨itamin C

大豆子叶中的贮藏物质有蛋白质、脂肪和碳水化合物，在种子萌发过程中它们提供氮源、碳源和能量。大豆蛋白质含量高、构成蛋白质氨基酸平衡性好，是世界上最经济的食物蛋白质来源，人类获取植物蛋白60%来自于大豆。大豆经发芽处理后，营养价值进一步提高，并可形成独特的口感和风味。大豆种子的发芽是一个需要巨大能量的过程，种子中贮藏了富含化学能的有机物，发芽时转化为容易被胚吸收的形态，这些变化必须有酶的作用。种子发芽时酶的活化是最明显的现象。大豆子叶中的贮藏物质有蛋白质、脂肪等，种子萌发过程中它们提供氮源、碳源，故蛋白酶、脂肪酶对种子的萌发尤为重要。大豆脂肪氧化酶含有三种同功酶（L-1、L-2、L-3），分别由一对基因控制。现日本已经选育出大豆种子单缺失、双缺失和三缺失的品种［1］。本实验主要对大豆中的三种脂肪氧化酶同工酶进行检测分析，并对大豆发芽过程中脂肪氧化酶、内源蛋白酶的活性进行测定，为合理开发利用大豆中的内源蛋白酶和脂肪氧化酶提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆沈农8号，沈阳农业大学实验田。

UV-1600分光光度计北京普析公司；TGL-16C离心机上海安亭仪器厂；DFT-100手提式高速中药粉碎机温岭市大德中药机械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大豆发芽选取成熟、饱满、没有破损的大豆籽粒，用清水洗3遍，然后在室温下浸泡过夜。浸泡后的大豆用水清洗1遍，然后放入培养皿中，培养皿下铺1层纱布，大豆表面再盖2层纱布。放入25℃的恒温培养箱中进行发芽实验，每天用清水适当清洗。

1.2.2 发芽大豆粉的制备分别取发芽时间为0、1、2、3、4d的萌动或发芽大豆，研碎后，鼓风干燥。然后用粉碎机粉碎，即可得到不同发芽时间的发芽大豆粉。

1.2.3 大豆提取液的制备取不同发芽时间的发芽大豆粉100g于试管中，加入5mL蒸馏水，5mL硼酸缓冲液，振荡30min，用滤纸过滤，硼酸缓冲液清洗三次，滤液在50mL容量瓶中定容，得到大豆提取液。

1.2.4 脂肪氧化酶同功酶的测定［2］

1.2.4.1 缓冲溶液的制备硼酸缓冲液（0.2mol/L，pH9.0）：将11.1g NaCl和 3.8g Na2B4O7·10H2O 用蒸馏水定容至1.0L得到硼酸钠缓冲溶液，用于L-1的测定。硼酸钠缓冲溶液（0.2mol/L，pH6.0）：称8.8gNaCl，6.0g NaH2PO4·H2O 和 0.9g Na2HPO4·H2O用蒸馏水定容至1.0L，用于L-2的测定。

硼酸钠缓冲溶液（0.2mol/L，pH6.6）：称 8.8g NaCl，5.2g NaH2PO4·H2O 和 1.8g Na2HPO4·H2O 用蒸馏水定容至1.0L，用于L-3的测定。

1.2.4.2 脂肪氧化同功酶的测定分别取用于测定L-1、L-2、L-3的硼酸缓冲液2.975mL，加入亚油酸钠0.025mL，大豆提取液30!L。空白对照为硼酸缓冲液2.975mL，亚油酸钠0.025mL。分别在234、238、280nm下测吸光度30min，得到OD变化最大值MAX（△OD/min）。标准曲线：pH9.0的硼酸缓冲液2.975mL，加入 5、10、20、30、40!L 脂肪氧化酶，亚油酸钠0.025mL，在234nm下测吸光度30min。得到OD最大变化值 MAX（△OD/min），空白对照为pH9.0的硼酸缓冲液2.975mL，亚油酸钠0.025mL。以OD最大变化值MAX（△OD/min）为横坐标，脂肪氧化酶为纵坐标，作大豆脂肪氧化酶的标准曲线。

1.2.5 大豆发芽过程中脂肪氧化酶活性的测定取不同发芽时间的大豆提取液30!L，pH9.0的硼酸缓冲液2.975mL，亚油酸钠0.025mL，在234nm下测吸光度30min，得到OD最大变化值MAX（△OD/min）。

1.2.6 发芽大豆内源蛋白酶活性的测定取不同时间的发芽大豆粉0.1g溶于10mL 0.2mol/L pH7.5的磷酸缓冲液中溶解。取2mL溶液加入0.5%酪蛋白溶液2mL，37℃摇匀，反应20min，加入10%三氯乙酸4mL终止反应，3000r/min离心10min，取上清液，在275nm下测 OD值。空白对照：酶液2mL（预热至37℃），加入三氯乙酸4mL，0.5%酪蛋白溶液4mL，37℃下摇匀反应20min，3000r/min离心10min，取上清液。以OD值为横坐标，酪氨酸含量为纵坐标，制作标准曲线。每个样品做三个平行。在37℃下，每分钟水解酪蛋白产生1!g的酪蛋白为1个酶活力单位。1酶活力单位（U/g）=（H×F）/（15×0.05），H为根据吸光值从标准曲线中查得的酪氨酸含量，!g/mL；F为酶液的最终稀释倍数。

1.2.7 游离氨基酸的测定茚三酮比色法。取发芽0、1、2、3、4d 的大豆粉 0.1g溶于 10mL 水中，置于25mL容量瓶中，加热10min，室温冷却后4000r/min离心 10min，取上清液，加入 2%茚三酮溶液和pH8.04磷酸缓冲液4.0mL，混合均匀，于沸水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比，测定其余各溶液的吸光度 A。以氨基酸的含量（!g/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.8 大豆发芽过程中脂肪含量的测定采用索氏提取法。

1.2.9 大豆发芽过程中维生素C的测定采用磷钼酸法。

2 结果与分析

2.1 脂肪氧化同功酶的测定

脂肪氧化同功酶的OD变化最大值 MAX（△OD/min）值如表1所示。

表1 脂肪氧化同功酶的OD变化最大值MAX（△OD/min）

由表1可以看出，沈农8号的脂肪氧化酶活力以L-1、L-2为主，并且L-1的活力略高于L-2；L-3缺失，可以看出沈农8号是L-3缺失品种。

2.2 大豆发芽过程中脂肪氧化酶活性的测定

发芽0、1、2、3、4d 的大豆粉脂肪氧化酶活力如表2所示。

表2 大豆发芽过程中脂肪化酶的活性变化

由表2可以看出，随着大豆的发芽，脂肪氧化酶的活性逐渐降低，从大豆浸泡到大豆发芽第4d，脂肪氧化酶的活性降低了47.5%，这对开发低豆腥味食品有一定的参考作用。

2.3 大豆发芽过程中内源蛋白酶活性的测定

不同发芽时间的大豆粉内源蛋白酶活力如图1所示。

图1 大豆种子萌发过程中内源蛋白酶含量的变化

由图1可以看出，从大豆浸泡阶段内源蛋白酶活力开始逐渐增强，在发芽第3d活力有所降低，而后又略有升高。从大豆萌发的第3d，开始大豆芽生长较快，可能与内源酶的活性有关，内源酶的活性越高，为豆芽生长提供更多的营养物质，豆芽生长越快。

2.4 大豆发芽过程中游离氨基酸的变化

大豆发芽过程中游离氨基酸含量变化如图2所示。

图2 大豆种子萌发过程中游离氨基酸含量的变化

由图2可以看出，在大豆发芽的前2d（48h内），游离氨基酸的含量不断增加；在48h后，游离氨基酸含量出现降低的趋势。分析认为，大豆萌动期，子叶中蛋白质开始部分酶解成游离氨基酸，为发芽过程提供可供幼芽吸收的能量，发芽2d后，大豆胚根生长则导致氨基酸的进一步降解，到第4d，可能又有新的氨基酸合成。游离氨基酸的含量与内源蛋白酶的活性也密切相关。

2.5 大豆发芽过程中脂肪含量的变化

大豆发芽过程中脂肪的变化如表3所示。

表3 大豆发芽过程中脂肪含量的变化（g/100g）

由表3可以看出，随着大豆的萌发，脂肪的含量逐渐下降，这可能是由于一部分的脂肪转化成了豆芽生长所需的能量。

2.6 大豆发芽过程中维生素C的含量变化

对大豆发芽过程中的维生素C的含量变化进行测定，结果见表4。

表4 大豆发芽过程中维生素C含量的变化（mg/100g）

由表4可以看出，在大豆发芽过程中维生素C的含量显著增加。在未发芽的大豆中未检出维生素C，而在发芽的第1d就增加到了4.34mg/100g豆芽，这也是大豆发芽的好处之一。

3 讨论

3.1 脂肪氧化酶同功酶缺失的原因

脂肪氧化酶能催化大豆中的不饱和脂肪酸氧化，产生醛、酮等有害物质，使大豆及其制品产生豆腥味，阻碍大豆在食品中的广泛应用。而大豆中存在三种脂肪氧化酶同功酶，人们已经通过控制基因等手段培育出某种同功酶缺失的品种。本实验中未在沈农8号中检出L-3，说明沈农8号为L-3缺失品种。脂肪氧化酶的活力L-1略高于L-2，测定L-1的活性作为大豆脂肪氧化酶变化的参照。

3.2 脂肪氧化酶活性降低的原因

已有研究表明，大豆的脂肪氧化酶会随着种子发育而产生较大变化。在幼芽生长的初期通常都表现出很高的酶活性，随着种子的萌发，活性逐渐降低。大豆发芽后脂肪氧化酶的活性降低了47.5%，这对开发低豆腥味的大豆食品有一定的参考价值。

3.3 内源蛋白酶游离氨基酸含量的变化

大豆的内源蛋白酶出现了两个峰值，在第2d和第4d活性较高。内源酶的活性与游离氨基酸的含量密切相关。焉华娟、郭顺堂的研究表明［3］，在大豆萌发过程中，从浸泡内源蛋白酶就开始启动，在48h时达到峰值，这与游离氨基酸的含量变化基本是一致的。由此可见，在发芽大豆中蛋白酶控制着蛋白质的降解。在48h后，大豆芽生长速度极快，导致了游离氨基酸被大量消耗，致使在48h后游离氨基酸的含量出现了降低趋势。第4d，豆芽生长速度减慢，可能又有新的氨基酸生成。