常丽新，贾长红，高 曼，王 倩

（河北理工大学化工与生物技术学院，河北唐山063009）

丁香叶黄酮的抑菌作用研究

常丽新，贾长红，高 曼，王 倩

（河北理工大学化工与生物技术学院，河北唐山063009）

利用70%乙醇作为提取剂，采用微波法提取丁香叶黄酮，研究了丁香叶黄酮对白葡萄球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性。结果表明：丁香叶黄酮对三种细菌均有较好的抑制作用，特别对大肠杆菌的抑制效果最好，其次是白葡萄球菌，对金黄色葡萄球菌的抑制效果略差；丁香叶黄酮提取液的用量为3mL时，对三种细菌均具有明显的抑制作用，最低抑菌浓度为942.21!g/mL。pH小于10时具有明显的抑菌活性，且热稳定性好。

丁香叶，黄酮，抑菌作用

Abstract：Using 70%（∨/∨%）ethanol as solvent，the favonoids of lilac leaves was extracted by micro-wave，and the antimicrobial effect of flavonoids on E.coli，S-taphylococcusaureus and S.albus was studied.The results showed that favonoids of lilac leaves could effectively inhibit the growth of bacteria，especially on E.coli，secondly S.albus，then S-taphylococcusaureus；when the extracting volume of favonoids was 3mL，antimicrobial effect was obvious，the antimicrobial minimum dosage acted as 942.21μg/mL.When the pH range of inhibiting bacteria was lower 10，the heat stability was good.

Key words：lilac leaves；favonoids；antimicrobial effect

丁香亦名丁子香、鸡舌，为木犀科，丁香属植物，在我国资源丰富，分布较广。丁香有抗菌、消炎、抗病毒等功效，如可用紫丁香叶提取物治疗菌痢以及急性黄疸型肝炎［1］。黄酮是存在于植物体内一大类物质，能够有效清除体内的自由基及毒素，预防、减少疾病的发生，还具有消炎、抗过敏、广谱抗菌、抗病毒作用［2］。本研究以丁香叶为材料，利用70%乙醇作为提取剂，采用微波法提取黄酮，探讨了丁香叶黄酮对三种细菌的抑制效果，为丁香的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

丁香叶 采集河北理工大学校园，将丁香叶先用自来水洗净，再用蒸馏水洗2遍，用滤纸或纱布吸干水，于90℃杀酶 15min，在 60～65℃烘干至脆，粉碎，过筛，备用；大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（S-taphylococcusaureus）、白葡萄球菌（S.albus） 由华北煤炭医学院提供；牛肉膏蛋白胨培养基。

HSP200-恒温生化培养箱 中国科学院武汉科学仪器厂；YXQG02型电热式高压蒸汽灭菌锅 山东新华医疗器械股份有限公司；8002型恒温水浴锅天津中环科技开发公司；752型紫外-可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；202-0台式电热干燥箱、电子天平 泰斯特仪器有限公司；WG700SL23-K6微波炉 格兰仕；不锈钢分析筛 浙江上虞市华丰五金仪器有限公司；微量移液器 大龙医疗设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 丁香叶黄酮提取液的制备

1.2.1.1 标准曲线的绘制 准确称取芦丁0.0250g于100mL容量瓶中，加80%乙醇溶解，定容。准确吸取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0mL 于 50mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠1.5mL，混匀，放置6min，加入10%硝酸铝1.5mL，混匀，放置6min，加4%氢氧化钠20mL，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置15min。以蒸馏水为空白，在510nm下测定吸光度。而后以芦丁含量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得直线回归方程为：

1.2.1.2 丁香叶黄酮含量的测定 准确移取5mL提取液于50mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠1.5mL，混匀，放置6min，加入10%硝酸铝1.5mL，混匀，放置6min，加4%氢氧化钠20mL，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置15min。以蒸馏水为空白，于510nm处测定吸光度值，从工作曲线方程中查出黄酮，计算出总黄酮含量（g）。

表1 不同浓度丁香叶黄酮提取液的抑菌圈直径（cm）

1.2.1.3 丁香叶黄酮的得率计算

丁香叶黄酮得率（%）=丁香叶黄酮含量/丁香叶重量×100%

1.2.1.4 丁香叶黄酮提取液的制备 称取一定量的100目丁香叶粉末，按照固液比1∶40，加入一定体积70%乙醇溶液中，静置1h，而后在微波炉低火下加热1.5min，过滤后即得到原液，计算黄酮得率为3.77%，相当于原液中黄酮浓度为942.21!g/mL。丁香叶黄酮原液在实验前经针孔过滤器（0.22!m）除菌。

1.2.2 菌种的活化 从供试菌种管中分别挑取少许菌种接种于试管斜面培养基上，每一菌种重复5次，于37℃恒温培养箱中倒置培养24h。

1.2.3 菌悬液的制备 分别用接种环挑取1环菌体于50mL无菌生理盐水中，在摇床上振摇培养制成菌悬液。

1.2.4 丁香叶黄酮提取物的抑菌实验

1.2.4.1 不同浓度丁香叶黄酮提取液的配制 将丁香叶黄酮原液的浓度视为100%，采用二倍稀释法［3］用无菌水配制成不同浓度的溶液，依次为100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.563%，分别相当于黄酮浓度为 942.21、471.11、235.55、117.78、58.89、29.44、14.72!g/mL。

几年前，父亲带着李离入蜀，去看青衣江上的佛像。川人集合了数千工匠，花掉了四十余年的时间，将一座山峰雕成慈眉善目的如来立像，秋风秋雨中，释迦牟尼的眉眼音容依稀已经出现，工人们搭着梯子，腰上缠着麻绳，举锤布凿，敲打他厚实的耳垂，慢慢将佛祖由山岭间唤醒。

1.2.4.2 抑菌圈直径的测定 将滤纸用打孔器打成若干9mm圆片，高压灭菌，备用。在超净工作台上，将灭菌后的培养基倒入无菌培养皿中，每皿15mL，冷却凝固后，用无菌移液管吸取0.2mL菌悬液，加入到上述培养皿，用刮铲将菌悬液涂匀。将灭菌后的滤纸片浸入不同浓度丁香叶黄酮提取液中30min，用无菌镊子取出，晾干，平铺于上述培养皿上。每皿呈十字铺4片，每个浓度重复3次。然后于37℃恒温培养箱中倒置培养24h，观察记录细菌生长情况，用刻度尺测定抑菌圈直径，每一菌种重复3次。同时做空白，即以无菌生理盐水代替丁香叶黄酮提取液，其他操作均同上。

1.2.4.3 丁香叶黄酮提取液用量对抑菌效果的影响

首先向已灭菌的培养皿中分别加入2、3、4mL黄酮浓度为942.21!g/mL原液，然后倒入15mL已灭菌的培养基，混匀，冷却凝固，用无菌移液管吸取0.1mL菌悬液，加入到上述培养皿，用刮铲将菌液涂均。而后于37℃恒温培养箱中倒置培养24h，观察记录细菌生长情况，以得出适宜的丁香叶黄酮提取液的用量。

1.2.4.4 最低抑菌浓度的测定 在培养皿中加入适量体积不同浓度的丁香叶黄酮提取液，然后倒入15mL培养基，混匀，冷却凝固后，用无菌移液管吸取0.1mL菌悬液，加入到上述培养皿，用刮铲将菌液涂匀，然后37℃恒温培养箱中倒置培养24h，观察记录细菌生长情况，每个浓度重复3次，每种一菌种重复3次。观察记录细菌生长情况，以不长菌的浓度为最低抑菌浓度。

1.2.4.5 pH对丁香叶黄酮提取物抑菌效果的影响在无菌条件下，分别取最低抑菌浓度的丁香叶黄酮提取液一定体积于无菌三角瓶中，用0.1mol/L氢氧化钠和0.1mol/L盐酸将最低抑菌浓度的黄酮溶液pH 调节为 2、4、6、8、10、12。

在培养皿中加入适量体积不同pH的最低抑菌浓度的溶液，然后倒入15mL培养基，混匀，冷却凝固，用无菌移液管吸取0.1mL菌种液，加入上述培养皿中，用刮铲将菌液涂匀，然后于37℃恒温培养箱中倒置培养24h，观察记录细菌生长情况，每一pH重复3次，每一菌种重复3次。

分别取最低抑菌浓度的丁香叶黄酮提取液于无菌三角瓶中，瓶口盖好保鲜膜，分别在 60、70、80、90、100℃水浴中加热30min后取出，在无菌条件下冷却至室温。在培养皿中加入适量体积经上述处理的最低抑菌浓度的黄酮提取液，然后倒入15mL细菌培养基，混匀，冷却凝固，用无菌移液管吸取0.1mL菌悬液，加入到上述培养皿，用刮铲将菌液涂匀，然后于37℃恒温培养箱中倒置培养24h，观察记录细菌生长情况，每个温度重复3次，每一菌种重复3次。

2 结果与讨论

2.1 滤纸片法测定抑菌效果

从表1中可以看出，随丁香叶黄酮提取液浓度的降低，三种菌的抑菌圈直径均逐渐变小。其中以浓度942.21!g/mL的抑菌圈直径最大。从对三种菌的抑制效果看，对大肠杆菌的抑制效果最好，其次是白葡萄球菌，对金黄色葡萄球菌的抑制效果略差。

2.2 丁香叶黄酮提取液的用量对抑菌效果的影响

由表2可知，浓度为942.21!g/mL丁香叶黄酮提取液的用量不同，抑菌效果也不同。对于大肠杆菌，用量2、3、4mL均有明显的抑制作用，无菌落生长；金黄色葡萄球菌、白葡萄球菌用量2mL时抑制作用不明显，有少量菌落生长，用量3、4mL时有明显的抑制作用，无菌落生长。因此丁香叶黄酮提取液的用量选择3mL为宜。

表2 丁香叶黄酮提取液的用量对抑菌效果的影响

2.3 最低抑菌浓度的测定

最低抑菌浓度（MIC）是指能够抑制培养基内细菌生长的最低浓度。由表3可以得出，黄酮提取物浓度为942.21!g/mL时抑菌效果最明显，无菌落生长。而随着提取液黄酮浓度的降低，抑菌效果越来越不明显，因此确定最低抑菌浓度为942.21!g/mL。

表3 不同浓度丁香叶黄酮提取物的抑菌效果

2.4 pH对丁香叶黄酮提取物抑菌效果的影响

由表4可看出，丁香叶黄酮提取物在pH≤10时，有明显的抑菌效果，无菌落生长；pH为12时，抑菌效果不明显，有少量菌生长。

表4 pH对丁香叶黄酮提取物抑菌效果的影响

2.5 温度对丁香叶黄酮提取物抑菌效果的影响

从表5中可以看出，丁香叶黄酮提取物随温度的升高抑菌作用没有改变，说明丁香叶黄酮提取物的抗热性很强，性质较稳定。

表5 温度对丁香叶黄酮提取物抑菌效果的影响

3 结论

以丁香叶为材料，利用70%乙醇作为提取剂，采用微波法提取黄酮，研究发现，丁香叶黄酮提取液对三种细菌均具有明显的抑制作用，其中对大肠杆菌的抑制效果最好，其次是白葡萄球菌，对金色黄葡萄球菌的抑制效果略差；丁香叶黄酮提取液的用量为3mL时，对三种细菌均具有明显的抑制作用，最低抑菌浓度为942.21!g/mL。其抑菌作用在pH≤10时，效果明显，而且抑菌作用不受温度的影响，热稳定性好。

［1］江苏医学院.中药大辞典［M］.上海：上海人民出版社，1975：152-153.

［2］李云雁，宋光森.板栗壳提取物抑菌作用研究［J］.林产化学与工业，2004，24（4）：61-64.

［3］谷肄静，王立娟.蒲公英总黄酮的提取及其抑菌性能［J］.东北林业大学学报，2007，35（8）：43-45.

Study on antimicrobial effect of flavonoids from lilac leaves

CHANG Li-xin，JIA Chang-hong，GAO Man，WANG Qian
（Chemical Engineering and Biotechnology College，Hebei Polytechnic University，Tangshan 063009，China）

TS201.2

A

1002-0306（2010）10-0126-03

2009-08-14

常丽新（1965-），女，教授，硕士生导师，研究方向：天然产物的研究与开发。