孙 涛，江 波，*，潘蓓蕾，Rebaone Letsididi

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.中国食品科学技术学会，北京100006）

产环糊精葡萄糖基转移酶菌株的筛选、鉴定与应用研究

孙 涛1，江 波1，*，潘蓓蕾2，Rebaone Letsididi1

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.中国食品科学技术学会，北京100006）

利用产环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）菌株快速筛选法结合芦丁转糖基酶反应，筛选获得一株所产CGTase可高效转化芦丁的菌株。16S rRNA鉴定表明，此菌株和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）有100%的同源性。结合形态和生理生化鉴定，确定此菌株为地衣芽孢杆菌，命名为Bacillus licheniformis SK13.002。该菌株在pH约为10时生长良好，且具有最高的产酶量，显示其嗜碱性。此菌株所产酶以淀粉作底物所产环糊精为β-环糊精和γ-环糊精，其中β-环糊精所占比例为83.3%；两者产量分别达到20.9g/L和4.2g/L。直接利用浓缩酶液进行芦丁的糖基化，则可以得到近70%的转化率。

环糊精葡萄糖基转移酶，菌株，筛选，鉴定，应用

Abstract：Using rapid screening method combined with enzymatic transglycosylation reaction of rutin，a microbial strain producing cyclodextrin glucanotransferase（CGTase）with highly efficient transglycosylation of rutin was isolated from soil.Through morphological，biochemical，physiological and 16S rRNA analyses，this strain was identified as Bacillus licheniformis SK13.002 with a 100%identity.This strain grew well and produced the largest amount of CGTase at a pH around 10 indicating that it was alkaliphilic.The CGTase from this strain was utilized to convert 5%of soluble starch and the results revealed that the enzyme produced mainly β-CD at 83.3%of the total CDs yield and no α-CD was formed after 24h of reaction.The produced β-and γ-CDs corresponded to 20.9g/L and 4.2g/L，respectively.The enzyme was also used to carry out transglycosylation reaction of rutin；under the optimized enzymatic reaction conditions，conversion rate of rutin reached near 70%.

Key words：cyclodextrin glucanotransferase；Bacillus licheniformis；screening；identification；application

环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）为食品工业中的重要酶。CGTase催化4种不同的酶反应，分别为水解、环化、歧化和偶联反应［1］。CGTase通过环化作用可转化淀粉生成环糊精，根据葡萄糖残基的不同，分别称作 α-环糊精、β-环糊精和 γ-环糊精［2］。环糊精在食品中的应用广泛：主要用途包括将液体食品转化为固体粉末，以便于包装、运输、储藏和使用；稳定食品中的某些成分；消除食品中的异味等［3-5］。除用于环糊精的生产，还可以利用CGTase的转糖基反应对一些食品配料和功能性成分进行酶法改性。比如葡萄糖基-L-抗坏血酸的制备［6］；一些黄酮类化合物，如芦丁的改性［7］；甜味剂的改良等［8］。可以产CGTase的微生物主要是芽孢杆菌属（Bacillus），包括嗜热脂肪芽孢杆菌（B.stearothermophilis）、耐碱性巨大芽孢杆菌（B.megateruim）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、环化芽孢杆菌（B.circulans）、枯草芽孢杆菌（B.Subtilis）等。除芽孢杆菌外，可以产CGTase的微生物还包括短杆菌（Brevibacterium）、梭菌（Clostridium）、棒杆菌（Corynebacterium）、克雷伯氏菌（Klebsiella）、微 球 菌（Micrococcus）、假 单 胞 菌（Pseudomonas）及曲霉（Aspergillus）等［2，9］。产 CGTase菌株筛选，多以生产环糊精为目的；对于以利用CGTase的转糖基作用对功能性成分进行酶法改性为目的进行菌株筛选的研究则鲜见报道。本实验利用产CGTase菌株快速筛选法［10］结合芦丁转糖基反应，从淀粉厂厂区土壤样品中筛选获得一个菌株；此菌株具有较高的转糖基活性。对该菌株进行了形态学、生理生化和16S rRNA鉴定，并对利用该菌株所产酶转化淀粉生成环糊精以及芦丁的转糖基反应进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

土样 取自无锡双佳淀粉厂厂区；芦丁 南京泽朗医药科技有限公司；乙腈 色谱纯，Sigma公司；其他试剂 上海国药集团；环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase） 用菌株Bacillus licheniformis SK13.002发酵制得。

DKY-Ⅱ恒温调速回转式摇床 上海杜科自动化设备有限公司；Eppendorf 5804R低温高速离心机德国 Eppendorf公司；Millipore超滤设备 美国Millipore公司；恒温水浴振荡器 江苏金坛市亿通电子有限公司；Agilent高效液相色谱仪 Agilent 1200。

1.2 实验方法

1.2.1 产CGTase微生物快速筛选 快速筛选方法参照Park等［10］的报道。筛选平板培养基的组成为：1%可溶性淀粉，0.5%蛋白胨，0.5%酵母膏，0.1%K2HPO4，0.02%MgSO4·7H2O，1%Na2CO3，1.5% 琼脂，0.03%酚酞和0.01%甲基橙。

1.2.2 菌株形态、生理生化和16S rRNA分析鉴定菌株形态、生理生化鉴定利用 Biolog OmniLog Identification System（美国Biolog公司）自动分析完成。16S rRNA基因扩增用引物为通用引物，27F 5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 1527R 5′-AGAAA GGAGGTGATCCAGCC-3′。分析鉴定由中国典型物保藏中心（CCTCC）完成。

1.2.3 发酵产CGTase 产酶液体培养基的组成为：1% 可溶性淀粉，1% 大豆蛋白胨，0.5% 酵母膏，0.1%K2HPO4，0.02%MgSO4·7H2O 和 0.8%Na2CO3。

1.2.4 芦丁酶转化方法 芦丁的酶法转化方法参照Suzuki等的方法［7］，并对酶反应条件进行了优化。具体方法如下：0.1g芦丁溶解在5mL甲醇中，0.5g糊精溶解在5mL 0.2mol/L的醋酸钠缓冲液中（pH 5.5）。二者均匀混合，混合液中含有10mmol/L CaCl2。加入适量浓缩酶液，置水浴振荡器中进行酶反应。反应温度为35℃，水浴振荡器的转速为200r/min，酶反应持续进行72h。反应液沸水浴灭酶后高速离心，过0.45μm膜后待HPLC测定。

1.2.5 糖基化芦丁的测定 酶法转化生成产物糖基化芦丁的测定采用高效液相色谱（HPLC）法。色谱条件如下：色谱柱：Agilent公司 ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.5mm×150mm，5μm）；流动相：V（乙腈）∶V（超纯水）∶V（甲酸）=18∶81.9∶0.1；流动相流速：0.8mL/min；进样量：5μL；紫外检测波长：254nm；柱温：30℃。

1.2.6 淀粉转化生成环糊精 5%（w/v）的可溶性淀粉的 Tris-HCl缓冲液（50mmol/L，pH 7.0）中加入适量浓缩酶液，65℃水浴24h。反应液沸水浴灭酶，α-淀粉酶处理后高速离心，过0.45μm膜后待HPLC测定。

1.2.7 环糊精的测定 环糊精的测定采用HPLC法。色谱条件如下：色谱柱：Asahipak NH2P-50 4E Shodex column（4.6mm id × 250mm，Tokyo，Japan）；流动相：V（乙腈）∶V（超纯水）=70∶30；流动相流速：1.0mL/min；进样量：5μL；示差折光检测器检测；柱温：30℃。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选和鉴定

利用产CGTase菌株快速筛选方法，筛选获得18个具有较高CGTase酶活的菌株，菌株发酵液中酶活从2.8U/mL到4.1U/mL不等。利用这些菌株发酵得到的发酵液，进行芦丁的转糖基反应，通过比较芦丁的转化率，最终获得一株菌株，所产酶液可高效转化芦丁获得糖基化芦丁。对此菌株进行形态学、生理生化和16S rRNA鉴定。

生理生化和形态学鉴定结果列于表1中。结果显示，该菌株为杆状的革兰氏阳性菌，可产生芽孢。可利用淀粉，还原硝酸盐为亚硝酸盐等。

表1 菌株生理生化和形态学鉴定

16S rRNA鉴定结果表明，该菌株16S rRNA序列共1472bp，将序列到NCBI进行BLAST，结果发现，它与地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的16S rRNA序列同源性最高，达到了100%。将其16S rRNA序列提交GenBank得到的接受号为GU570959。结合生理生化和形态学鉴定结果，确定该菌为地衣芽孢杆菌，命名为Bacillus licheniformis SK13.002。

B.licheniformis SK13.002发酵产酶实验中研究了培养基中Na2CO3浓度和pH对产酶的影响，结果显示（表2），在Na2CO3浓度为0.8%，pH约为10时菌株的产酶量最高，达到了4.12U/mL；此外，在此条件下，菌株的生长状况良好，显示其嗜碱性。

表2 培养基Na2CO3浓度和pH对产酶的影响

表3 不同来源CGTase生成环糊精比较

2.2 环糊精生产

利用B.licheniformis SK13.002发酵得到的粗酶液，以5%的可溶性淀粉作为底物生成环糊精，在没有经过任何优化的情况下获得了50.2%的产率。产物中含有83.3%的β-环糊精和16.7%的γ-环糊精；β-环糊精和γ-环糊精的比率为4.99∶1；产物中不含α-环糊精。酶反应产物中β-环糊精和γ-环糊精的含量分别达到20.9g/L和4.2g/L。

在酶反应过程中，反应产物环糊精，特别是β-环糊精在最初的12h快速增加，β-环糊精达到16.1g/L；在之后的12h则缓慢增加，最终β-环糊精含量达到20.9g/L，β-环糊精的比例超过80%，说明该菌株具有实际应用于环糊精生产的潜力。不同来源的CGTase转化淀粉生成环糊精的种类和比例不同，通常为三种环糊精的混合物。将本实验中菌株所产CGTase转化淀粉生成环糊精同其他来源CGTase生成环糊精进行比较，结果列于表3中。

另外，在Hill等［16］的研究报道中，地衣芽孢杆菌以淀粉作为底物生产环糊精，所产的环糊精为α-环糊精和β-环糊精，产物中没有γ-环糊精。本研究同其结果存在差异，具体原因有待于进一步的研究探讨。

2.3 芦丁糖基化

利用B.licheniformis SK13.002发酵得到的发酵液，经过超滤浓缩获得的浓缩发酵液，直接进行芦丁的转糖基酶反应。经过酶反应条件的优化，芦丁的转化率（糖基化芦丁/糖基化芦丁 +残余芦丁 ×100%）得到了提高；在优化后的酶反应条件下，利用浓缩发酵液，芦丁的转化率达到了近70%。芦丁经过糖基化后生成的糖基化芦丁（葡萄糖基芦丁），水溶性提高3×104倍，稳定性也得到提高［7］。

酶反应产物的HPLC谱图参见图1。图中芦丁的保留时间为6.12min，糖基化芦丁（G1-rutin，G2-rutin，G3-rutin分别表示芦丁中转入1，2，3个葡萄糖单元）分别为5.73、5.06、4.52min。

图1 酶反应产物HPLC谱图

3 结论

从土样中筛选得到一个产CGTase的菌株，经形态学、生理生化和16S rRNA基因序列分析，鉴定为B.licheniformis，命名为B.licheniformis SK13.002。利用B.licheniformis SK13.002发酵获得的酶液，以可溶性淀粉作底物，生成的环糊精主要为β-环糊精，另外还有少量的γ-环糊精，其中β-环糊精超过80%；环糊精的产率达到50.2%。浓缩酶液亦可直接用作芦丁的酶法糖基化，在优化后的酶反应条件下，芦丁的转化率达到近70%。总之，B.licheniformis SK13.002在芦丁糖基化和环糊精生产具有潜在的应用价值。

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Screening，identification and applications of a cyclodextrin glucanotransferase-producing microbial strain

SUN Tao1，JIANG Bo1，*，PAN Bei-lei2，Letsididi Rebaone1
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Chinese Institute of Food Science and Technology，Beijing 100006，China）

TS201.3

A

1002-0306（2010）10-0210-04

2010-05-13 *通讯联系人

孙涛（1969-），男，博士研究生，讲师，研究方向：食品酶与生物技术。

江苏省自然基金创新学者攀登项目（BK2008003）。