李光光 陈国菊 曹必好 张财顺 雷建军

（华南农业大学园艺学院生物技术研究所，华南农业大学园艺学院蔬菜系，广东广州 510642）

不同辣椒基因型辣椒素的积累特性

李光光 陈国菊 曹必好 张财顺 雷建军*

（华南农业大学园艺学院生物技术研究所，华南农业大学园艺学院蔬菜系，广东广州 510642）

用高效液相色谱法（HPLC）检测4份辛辣型辣椒材料在花后10个时期果肉、胎座和种子的辣椒素类物质的含量。结果表明，辣椒素类物质以胎座中最高，果肉次之，种子最少，其中牛角椒类型华椒3号、华椒4号和华椒5号的辣椒素类物质含量在花后40～50 d达到最高，朝天椒在花后25 d达到最高。

辣椒素；二氢辣椒素；HPLC；胎座；果肉

辣椒素（Capsaicin）最早由Thres（1876年）从辣椒（Capsicum annuum L.）果实中分离出来，是一种香草酰胺衍生物，化学结构为8-甲基-N-香草基-6-壬烯基酰胺（C18H27NO3）。其中，辣椒素占69 %，是辣味的主要决定因子；其次是二氢辣椒素（Dihydrocapsaicin），占22 %；其余同系物仅占少量，ω-羟基辣椒素是不辣的化合物（D í az et al.，2004）。迄今为止，已发现19种辣椒素同系物，其同系物结构类似辣椒素。它们具有显著的医疗与天然的防污、除污等作用。辣椒素具有加速脂肪燃烧（Badmaev & Majeed，1995）、抗菌消炎、镇痛（吴明光，1994）、增强机体耐力及抵抗力等药用作用（Hui et al.，2003；Srinivasan，2005），对实验性变应性鼻炎有治疗作用（陈丽 等，2009）。尽管国内已经在其提取工艺和辣椒素合成规律上有了很多的研究，但多数是关于辣椒果实以及制品中辣椒素的检测。本试验以辣椒不同器官、不同时间、不同品种的辣椒素含量为研究对象，以揭示辣椒素积累的一般规律。

1 材料与方法

1.1 材料

4份辛辣型辣椒材料（华椒3号、华椒4号和华椒5号果实大牛角形，果皮黄绿色有光泽，牛角椒类型；另一份为朝天椒）与2份甜椒材料（Sprite和Fiestae）均是华南农业大学园艺学院所有，于2008年12月随机种植在华南农业大学跃进北试验基地，2009年3月下旬开始现蕾开花，挂牌。在花后10、15、20、25、30、35、40、45、50、60 d的10个时期分别提取辛辣材料3个器官（胎座、果肉和种子）的辣椒素和二氢辣椒素。以2份甜椒材料商品成熟期的3个器官（胎座、果肉和种子）作阴性对照，3次重复。

1.2 方法

1.2.1 辣椒素类物质的提取 辣椒素类物质易溶于有机溶剂（狄云 等，1999），参考中华人民共和国国家标准（GB/T21266—2007）中的方法。将果实分为胎座、果皮和种子3个部分，50 ℃烘箱中烘干（水分含量15 %～20 %），趁热用研钵磨碎；准确称取2.500 g过40目筛的粉末样品，放入50 mL的离心管，贴上标签；分别加入甲醇（色谱醇，天津科密欧）+四氢呋喃（分析纯，广试一厂）（1 V∶1 V）混合液25 mL，盖上管，在60 ℃水浴条件下，使用超声波清洗器（用100 %功率）提取30 min；滤纸过滤，收集滤液。然后将滤渣连同滤纸，重复加入有机溶剂和超声波提取3次；3次过滤的滤液，用旋转蒸发器在75～80 ℃下浓缩至40 mL左右，加甲醇+四氢呋喃（1 V∶1 V）混合液定容于50 mL容量瓶（如果辣椒素类物质含量少，可浓缩定容在10 mL容量瓶中）；经0.45 μm滤膜过滤，进行色谱分析。

1.2.2 标准溶液的制备 精确称取50 mg辣椒素（纯度>95 %，美国）和50 mg二氢辣椒素（纯度>90 %，美国）放入经甲醇（HPLC专用色谱醇）洗涤过的烧杯中，迅速加少量甲醇溶解，然后将溶液转入25 mL容量瓶中，再用甲醇定容，作为标准母液贮存。分别吸取辣椒素、二氢辣椒素标准母液将其配制成1.00、0.50、0.25、0.20、0.10、0.05、0.01 mg·mL-1的混合标准溶液。

1.2.3 色谱条件 色谱柱为SB-C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），检测波长为280 nm，测定柱温为30 ℃，流动相为甲醇+水（4 V∶1 V），流速为1.0 mL·min-1，进样量为10 μL。

1.3 数据分析

按上述色谱条件进行HPLC分析，用标准混合液的色谱峰所保留的时间定性，用辣椒素、二氢辣椒素标准曲线及试样中的峰面积定量。根据标准辣椒素和二氢辣椒素的含量绘制标准曲线，试验数据用SAS统计软件处理。

1.3.1 辣椒素类物质的含量

公式 ① 中:X为试样中辣椒素或二氢辣椒素的含量；C为由标准曲线上查到的辣椒素或二氢辣椒素含量；V为样品定容体积；M为样品质量；w为辣椒素或二氢辣椒素标样纯度。

1.3.2 辣椒素类物质总量

公式 ② 中T为试样中辣椒素类物质总量；X1和X2分别为辣椒素和二氢辣椒素的含量；90 %为辣椒素与二氢辣椒素折算为辣椒素类物质总量的系数。

2 结果与分析

2.1 辣椒素类物质出峰结果

如图1、2所示，HPLC检测辣椒素、二氢辣椒素标样0.5 mg·mL-1的色谱图出峰时间分别为4.287、5.017 min，样品华椒3号胎座（25 d）辣椒素、二氢辣椒素的色谱图出峰时间分别为4.222、4.950 min，两者出峰时间大约是一致的，说明数据可用来分析辣椒素类物质的含量。

用混合标样得到的标准曲线方程分别为:辣椒素含量y=0.0004x+0.0146（R2=0.9796），二氢辣椒素含量y=0.0001x+0.0128（R2=0.9897）。

图1 HPLC检测标样的色谱图

图2 HPLC检测样品的色谱图

图3 辣椒素类物质在4份辛辣型辣椒品种中的含量变化

2.2 辣椒素类物质的方差分析

4份辛辣材料的胎座、果肉和种子在10个不同时期辣椒素、二氢辣椒素、辣椒素总量与斯科维尔指数（SHU）的方差分析结果可知:辣椒品种间（F=2.85，P<0.0001）、不同器官间（F=21.90，P<0.0001）以及不同时间之间（F=3.32，P=0.0019）差异极显著；3个不同器官的辣椒素和二氢辣椒素在不同基因型辣椒中（F=4.05，P=0.0102）差异显著。

用HPLC检测2份甜椒材料的胎座、果肉和种子的辣椒素类物质，结果表明:辣味材料的前15 d辣椒素类物质与2份甜椒材料的方差值为R2=1.0，说明辣椒素类物质并无显著的变化，辣味材料中辣椒素类物质的合成还没有开始。

2.3 辣椒素类物质含量的动态变化

采集不同时期的材料得到的辣椒素类物质的含量用HPLC检测，然后分别用辣椒素类物质的曲线方程计算，所得到的辣椒素类物质含量的动态变化如图3所示。不同材料的辣椒素类物质的积累过程基本上是一致的，在前期缓慢积累，到一定时期合成的辣椒素类物质急剧增加，后期减少。辣味材料中的辣椒素类物质以胎座中最多、果肉次之、种子中最少，而且辣椒素类物质的含量取决于基因型、器官以及开花后的时间。

辣味重的材料中只有朝天椒的辣椒素类物质的合成是在青果期达到最高峰，而其他3个辣味材料的辣椒素类物质含量都是在果色转红期最高。供试材料中的辣椒素类物质总量以华椒3号的胎座在50 d时含量最高，达23.55139 mg·g-1；而前期25 d，只有朝天椒的辣椒素总量最高，在胎座的含量达11.82893 mg·g-1，是同期果肉（0.30495 mg·g-1）的39倍。

3 结论与讨论

本试验用HPLC检测的2个甜椒材料的3个器官中辣椒素类物质含量都很低，一般认为甜椒材料的辣椒素类物质很低，HPLC几乎检测不到，而被当作无辣椒素类物质品种（Yazawa et al.，2004；成善汉 等，2009），且2个甜椒材料的3个器官辣椒素类物质含量与辛辣材料前15 d不同器官中含量的方差值为R2=1.0，说明辣椒素类物质的合成从开花后15 d才开始积累。辣椒素在果实中的含量极不均匀，3个器官的辣椒素类物质含量以胎座中的含量最高，果肉次之，与Jinap和Daund（1990）、Estrada等（2002）研究结果相同。这是因为控制辣椒素类物质合成的关键性限速酶主要定位于果实胎座表皮细胞的液泡膜上（Fujiwake et al.，1980），辣椒素类物质可以在果实胎座表皮细胞的液泡中首先形成，并通过子房隔膜运输到果肉表皮细胞的液泡中积累（Jinap ＆ Daund，1990），但大部分并未运送到果肉和种子，以及植株的茎秆和叶片中（Estrada et al.，2002）。戴雄泽等（2008）认为高辣味的辣椒以小辣椒为主，牛角型的辣椒属于低辣度类型。但本试验检测得到辣椒素类物质总量以华椒3号的胎座在50 d为最高，在前期25 d，只有朝天椒的辣椒素总量在胎座的含量最高，这可能是取材时期不一致的结果。

本试验结果表明，辣椒素类物质的含量在辛辣材料中都是先缓慢增加，到某一个时期，急剧累加到最大值，而后又逐渐减少。但在华椒系列3个材料（牛角椒）中是以红色期（花后40～50 d）为最高，这与张珍（2006）研究的中椒6号和辽椒7号辣椒素的累积结果一致；朝天椒以绿色期最高，且红色期果肉低于绿色期的辣椒素含量（Gnayfeed et al.，2001）。这是由于辣椒素在果实中的积累受到合成与降解两方面的共同调节，已有研究表明:辣椒果实中的过氧化物酶参与了辣椒素的氧化，使得辣椒素转化为其他次生物质，降低了辣椒果实中辣椒素的含量（Goodwin et al.，2003）。富宏丹等（2006）研究3个不同辣椒品种胎座和果肉中的辣椒素与其降解相关酶之间的关系，认为在整个辣椒果实发育时期，过氧化物酶、多酚氧化酶活性均和辣椒素含量呈一定的负相关。因此，这两种酶有可能参与了辣椒素的氧化降解，且在该过程中有互补作用。

辣椒素的检测有紫外分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法以及荧光分光光度法，这些分析方法都可以比较可靠地检测辣椒样品中的辣椒素类物质。本试验用HPLC检测到的辣椒素含量在0.05368～23.55139 mg·g-1，二氢辣椒素含量在0.00050～1.83186 mg·g-1。成熟期的辣椒中含有红色素，而红色素易溶于有机溶剂。陈小全等（2009）认为在50 ℃条件下，用超声波提取10 min就能得到红色素，而且在光照和加热的条件下极为稳定，本试验在未对粗样品提纯的情况下，用HPLC仍可以检测到辣椒材料中很微量的辣椒素类物质。但是在检测的峰图中，容易出现杂峰，干扰辣椒素类物质出现的时间。因此，要用标样反复检测辣椒素和二氢辣椒素的出峰时间，为准确找到对应的峰图位置作参照。

与标样得到的色谱图相比，样品的右部分色谱图有杂峰，是因为提取的样品未经过处理，含色素、蛋白、葡萄糖和脂肪等物质（石若夫和柯薇，2007），而这些提取物在不同基因型辣椒中含量差异较小（戴雄泽 等，2008），因而都表现出了对仪器检测结果的干扰。

陈丽，张奕，周明，沈志豪，王婷婷，杨志刚.2009.辣椒素治疗变应性鼻炎疗效分析.中华实用诊断与治疗杂志，24（1）:76-77.

陈小全，仇玉芹，周秀艳，张昌军，邵辉莹，左之利，翟虎，毕玉水.2009.超声波作用下提取辣椒红色素及稳定性实验.泰山医学院学报，30（7）:527-529.

戴雄泽，陈文超，张竹青，熊科，刘志敏.2008.不同辣度辣椒资源果实主要性状研究.湖南农业大学学报:自然科学版，24（4）:433-437.

成善汉，贺申魁，陈文斌，吴艳阁.2009.不同基因型辣椒的辣椒素含量测定和辣度级别分析.海南大学学报:自然科学版，27（1）:38-42.

狄云，蒋健箴，石正强.1999.辣椒果实中的辣椒素类物质研究进展.食品科学，（6）:30-32.

富宏丹，何莉莉，陈俊琴，赵瑞，王丽红.2006.不同品种辣椒POD和PPO活性与辣椒素含量的关系.沈阳农业大学学报，37（3）:479-481.

石若夫，柯薇.2007.辣椒素的提取和鉴定.安徽大学学报:自然科学版，31（5）:91-94.

吴明光.1994.新型长效镇痛药辣椒碱研究进展.中国新药杂志，3（4）:10-13.

张珍.2006.辣椒果实中辣椒素变化规律的研究〔硕士论文〕.泰安:山东农业大学.

Badmaev V，Majeed M.1995.Weight loss，the ayurvedic system.Total Health，17（4）:32-35.

D í az J，Pomar F，Bernal Á，Merino F.2004.Peroxidases and the metabolism of capsaicin in Capsicum annuum L. Phytochemistry Reviews，3:141-157.

Estrada B，Bernal M A，Diaz J.2002.Capsaicinoids in vegetative organs of Capsicum annuum L. in relation to fruiting.J Agric Food Chem，50（5）:1188-1191.

Fujiwake H，Suzuki T，Oka S，Iwai K.1980.Enzymatic formation of capsaicinoid from vanillylamine and iso-type fatty acids by cell-free-extracts of Capsicum annuum var. annuum. cv.Karayatsubusa.Agric Biol Chem，44:2907-2914.

Gnayfeed M H，Daood H G，Biacs P A，Alcaraz C F.2001.Content of bioactive compounds in pungent spice red pepper（paprika）as affected by ripening and genotype.Journal of the Science of Food & Agriculture，81（15）:1580-1585.

Goodwin，Douglas C，Hertwig K M.2003.Peroxidase-catalyzed oxidation of capsaicinoids:steady-state and transient-state kinetic studies.Archives of Biochemistry & Biophysics，417（1）:18-26.

Jinap S，Daund M.1990.Capsaicin in Capsicum annuum cultivars.Pertanike，13（2）:217-220.

Hui Kwokyin，Liu Beiying，Qin Feng.2003.Capsaicin activation of the pain receptor，VR1:Multiple open states from both partial and full binding.Biophysical Journal，84:2957-2968.

Srinivasan K.2005.Spices as influencers of body metabolism:an overview of three decades of research.Food Research International，38:77-86.

Yazawa S，Yoneda H，Hosokawa M，Fushiki T，Watanabe T.2004.Novel capsaicinoid like substances in the fruits of new non-pungent cultivar CH-19 sweet of pepper（Capsicum annuum）.Capsicum and Eggplant Newsletter，23:17-20.

Accumulative Characteristics of Capsaicin with Different Capsicumgenotypes

LI Guang-guang, CHEN Guo-ju, CAO Bi-hao, ZHANG Cai-shun, LEI Jian-jun*
（Biotechnology Institute of Horticulture College, South China Agricultural University, Vegetables Department of Horticulture College, South China Agricultural University, Guangzhou510642, Guangdong, China）

Capsaicin contents in pulp, placenta and seed of4 pepper（Capsicum annuum L.）accessions at10 periods were tested by HPLC. The result showed that capsaicin content was the highest in placenta, followed by pulp, and the least seed. The capsaicin content reached the highest at40-45th day after flowering in cayenne pepper varieties‘Huajiao No.3’，‘Huajiao No.4’and‘Huajiao No.5’.‘Chaotianjiao’reached the highest content at25th day after flowering.

Capsaicin; Dihydrocapsaicin; HPLC; Placenta; Pulp

S641.3

A

1000-6346（2010）24-0031-05

2010-06-29；接受日期:2010-08-20

国家支撑计划项目（2006BAD01A7-04-09）

李光光，硕士研究生，专业方向:蔬菜生物技术育种，E-mail:ligg007@sohu.com

*通讯作者（Corresponding author）:雷建军，教授，博士生导师，专业方向:蔬菜生物技术育种，E-mail:jjlei@scau.edu.cn