孔 青，刘奇正，耿 娟，王秀丹，于方塘

(1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003;2.山东省出入境检验检疫局检验检疫技术中心，山东青岛266005)

海洋巨大芽孢杆菌抑制黄曲霉毒素的生物合成

孔 青1，刘奇正1，耿 娟2，王秀丹1，于方塘1

(1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003;2.山东省出入境检验检疫局检验检疫技术中心，山东青岛266005)

从海洋中分离筛选出一株巨大芽孢杆菌，在PDA平板上此株巨大芽孢杆菌可以显著抑制黄曲霉的生长，进而重点研究其对黄曲霉毒素合成的影响。结果表明，在液体培养基中此株海洋巨大芽孢杆菌极显著地抑制黄曲霉产黄曲霉毒素(p＜0.01);另外研究发现，在受机械损伤的花生上，此株巨大芽孢杆菌也可显著抑制黄曲霉毒素的生物合成(p＜0.05);而在没有机械损伤的花生上，此株芽孢杆菌没能表现出抑制毒素合成的能力。抑制机理初步认为，该株海洋巨大芽孢杆菌通过竞争性生长和产生某种次级代谢产物，抑制黄曲霉的生长和黄曲霉毒素合成基因的表达。

巨大芽孢杆菌，抑制，黄曲霉，黄曲霉毒素

Abstract:A strain of marine Bacillus megaterium was screened from the ocean.This strain of B.megaterium exhibited high inhibitory effect on the growth of Aspergillus flavus on PDA plates，so the inhibitory effect on the biosynthesis of aflatoxin was further studied.The results showed this strain of B.megaterium could significantly inhibit the biosynthesis of aflatoxin both in liquid medium(p＜0.01)and mechanical damaged peanuts(p＜0.05)，but didn’t exhibit inhibitory biosynthesis effect in intact peanuts.The primary inhibitory mechanisms were accredited to competitive growth and some kinds of metabolites secreted by this strain of B.megaterium which could inhibit the growth of A.flavus and expression of the genes relating to aflatoxin biosynthesis.

Key words:Bacillus megaterium;inhibition;Aspergillus flavus;aflatoxin

黄曲霉毒素是一大群结构十分相似的曲霉的次生代谢产物，包括黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、黄曲霉毒素 M1(AFM1)、黄曲霉毒素 M2(AFM2)等18种之多，目前已证实能产生黄曲霉毒素(aflatoxin)的菌株主要是曲霉属的黄曲霉(Aspergillus flavus Link)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus Speare)［1］。大量的实验数据表明，黄曲霉毒素可使人类和多种动物诱发实验性肝癌，是目前已发现的最强的化学致癌物。我国是世界上最大的花生出口国，出口量占国际出口总量的三分之一，但是黄曲霉毒素是当前花生等粮食作物出口面临的最大技术性难题，也是2006年以来我国花生出口量持续下降的主要原因。所以，筛选出既可以抑制黄曲霉生长和毒素合成，又不会对花生等粮食作物产生二次污染，即安全无毒的抗黄曲霉微生物或功能因子，具有很大的开发潜力和研究价值。近几年，随着海洋生物技术的发展，从海洋生物中提取的抗菌活性物质层出不穷。覆盖地球表面积71%的海洋是生命的发源地，其生物多样性远远超过陆地;另外，海洋环境具有与陆地环境显著不同的特征，如高压、低营养、低温、无光照以及局部高温、高盐等所谓的生命极限环境，海洋微生物适应了海洋独特的生活环境，必然造就其独特的代谢途径和遗传背景，生物学特性有别于陆地微生物，具有产生抑制黄曲霉毒素生物合成的活性物质的巨大潜力［2－4］。目前，实验室已从黄海中分离筛选出一株抑制黄曲霉活性高的微生物，利用16S rDNA特异性扩增技术结合形态特征、生理生化实验对其菌种鉴定，结果表明这是一株海洋巨大芽孢杆菌。进而研究此株海洋巨大芽孢杆菌对黄曲霉菌丝延长和孢子萌发有显著的抑制作用，本文将重点研究此株巨大芽孢杆菌对黄曲霉毒素生物合成的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海洋巨大芽孢杆菌 分离自黄海，保存于中国海洋大学食品学院生物工艺实验室，采用牛肉膏蛋白胨培养基培养;黄曲霉(Aspergillus flavus Link)山东省花生研究所单世华研究员提供，采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar medium，PDA)培养;花生 市售，大小、成熟度均匀一致，无腐烂;Beacon黄曲霉毒素检测试剂盒 美国Beacon公司。

恒温振荡箱 上海福玛实验设备有限公司;超净工作台 苏净集团安泰公司;3－18R型高速冷冻离心机 美国TOMOS公司;Multiskan MK3型酶标仪

美国THEROM FISHER公司;恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂;QHX－300BS－Ⅲ人工气候箱 上海新苗医疗器械厂;高温蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂。

1.2 黄曲霉毒素的定量测定

采用Beacon黄曲霉毒素检测试剂盒进行测定。

对于液体中黄曲霉毒素的测定，每次测定直接取50μL液体按黄曲霉毒素检测试剂盒说明书操作。

对于花生中黄曲霉毒素的测定，测定前需要做如下预处理:a.粉碎花生，然后过20目筛;b.准确称5g粉碎的花生放入100mL蒸馏水中;c.剧烈振荡3min;d.静置 2～3min，使花生沉淀;e.用滤纸(Whatman GF/A)过滤，用干净的容器收集，滤液按黄曲霉毒素检测试剂盒说明书测定黄曲霉毒素含量。

1.3 抑制黄曲霉的生长

用无菌打孔器打直径6mm的长有黄曲霉的琼脂块倒置于PDA培养基平板中央，将两片直径6mm的无菌滤纸片分别放于距PDA平板中心2.5cm处。实验组在每张滤纸片上分别滴加8μL的巨大芽孢杆菌培养液(108CFU/mL)，对照组在滤纸片上滴加8μL无菌水，实验组和对照组各重复五个PDA平板，37℃恒温培养箱中培养 6d［5］。

1.4 抑制黄曲霉毒素的生物合成

106个/mL的黄曲霉孢子与108个/mL的海洋巨大芽孢杆菌混合培养于 PDA液体培养基中(含106个/mL的黄曲霉孢子的PDA液体培养基为对照)，28℃下摇床培养7d，每天用Beacon黄曲霉毒素检测试剂盒检测黄曲霉毒素含量。此实验重复3次。

1.5 抑制黄曲霉毒素在花生上的生物合成

取80个花生，在0.1%次氯酸钠溶液中浸泡消毒1min，自来水冲洗干净，自然风干后分成A(不打孔孢子)、B(不打孔混菌)、C(打孔孢子)、D(打孔混菌)四组，每组20个花生。C、D组的花生用无菌打孔器打出直径6mm，深约3mm的小孔。将A、C组的花生浸泡在黄曲霉孢子(106个/mL)溶液中侵染1min;将B、D组的花生浸泡在海洋巨大芽孢杆菌(108CFU/mL)和黄曲霉孢子(106个/mL)的混合液中侵染1min。将侵染后的A、B、C、D四组花生分别放入人工气候箱，控制温度28℃、相对湿度90%，培养7d后用Beacon黄曲霉毒素检测试剂盒检测各组花生中的黄曲霉毒素含量。此实验重复3次。

2 结果与讨论

2.1 抑制黄曲霉的生长

海洋巨大芽孢杆菌抑制黄曲霉生长的结果见图1，滤纸片周围有白色芽孢杆菌菌落，黄曲霉生长受到明显抑制(平板两侧的菌体是巨大芽孢杆菌;中间黄绿色的是黄曲霉);而对照组中黄曲霉长势良好，菌落布满整个平板。此实验结果表明，海洋巨大芽孢杆菌对黄曲霉的生长有明显抑制作用。

图1 巨大芽孢杆菌抑制黄曲霉的生长

2.2 抑制黄曲霉毒素的生物合成

海洋巨大芽孢杆菌抑制黄曲霉毒素合成的结果见图2，由图2可知，在第0d，液体培养基中的黄曲霉毒素含量在7ppb左右;但在培养的第1d，对照组(黄曲霉孢子)中的黄曲霉毒素含量迅速上升到101.07±4.16ppb，实验组(黄曲霉孢子和巨大芽孢杆菌)中的黄曲霉毒素含量上升到40.64±8.76ppb，巨大芽孢杆菌显著抑制了黄曲霉毒素在PDA液体培养基中的合成(p＜0.01);在培养的第2d，对照组中的黄曲霉毒素含量上升到112.36±5.17ppb，此后随着培养天数的增加，黄曲霉毒素含量并没有增加而保持相对稳定，说明此株黄曲霉主要在培养的前两天产生黄曲霉毒素(液体培养基中);实验组中的黄曲霉毒素含量从培养的第2d开始有所下降，在培养的第3d下降至14.66±1.52ppb，此后随着培养天数的增加保持相对稳定，于是推测，此株海洋巨大芽孢杆菌不仅能显著抑制黄曲霉毒素的生物合成，随着培养时间的延长，也可以降解或破坏一定量的黄曲霉毒素，所以具有很好的应用潜力。

图2 巨大芽孢杆菌抑制黄曲霉毒素的合成

2.3 抑制黄曲霉毒素在花生上的生物合成

由表1可以看出，A组和B组花生中的黄曲霉毒素含量没有显著差异，说明对于没有机械损伤的花生，花生本身具有一定抵御黄曲霉侵染的能力，海洋巨大芽孢杆菌没有表现出抑制黄曲霉毒素合成的能力;D组花生中的黄曲霉毒素含量显著低于C组花生中的黄曲霉毒素含量(p＜0.05)，说明对于有机械损伤的花生，花生本身将失去部分抵御黄曲霉侵染的能力，使得黄曲霉毒素含量显著上升(p＜0.05，与A组比较)，而此时海洋巨大芽孢杆菌表现出了抑制黄曲霉毒素在花生上生物合成的能力;C组花生中的黄曲霉毒素含量显著高于A组花生中的黄曲霉毒素含量(p＜0.05)，也说明了机械损伤使花生抵御黄曲霉侵染的能力下降;而D组花生中的黄曲霉毒素含量低于B组花生中的黄曲霉毒素含量，推测花生受到机械损伤后，反而有利于巨大芽孢杆菌依附在花生上，从而抑制黄曲霉毒素的生物合成。

3 结论

在海洋巨大芽孢杆菌抑制黄曲霉生长的实验中(图1)发现，该株巨大芽孢杆菌可显著抑制黄曲霉的生长，初步认为该株海洋巨大芽孢杆菌是通过竞争性生长和产生某种次级代谢产物来抑制黄曲霉菌丝的生长［6－7］。

在抑制黄曲霉毒素合成实验中(图2)，可以看出此株海洋巨大芽孢杆菌极显著地抑制黄曲霉产黄曲霉毒素(p＜0.01);另外研究发现，在受机械损伤的花生上，此株巨大芽孢杆菌也可显著抑制黄曲霉毒素的生物合成;而在没有机械损伤的花生上，没能表现出抑制毒素合成的能力(表1)。抑制机理初步认为是该株海洋巨大芽孢杆菌会抑制黄曲霉次级代谢产物调节基因和黄曲霉毒素合成基因的表达，如LaeA、aflR、aflS 等［7－8］。本项目小组将继续深入研究该株海洋巨大芽孢杆菌对黄曲霉毒素生物合成调节基因表达的影响，以更准确全面地阐明该株海洋巨大芽孢杆菌对黄曲霉毒素合成影响的本质。

［1］Bennett J W，Klich M.Mycotoxins［J］.Clinical Microbiology Reviews，2003，16(3):497－516.

［2］林白雪，黄志强，谢联辉.海洋细菌活性物质的研究进展［J］.微生物学报，2005，45(4):657－660.

［3］Hentschel U，Schmid M，Wagner M，et al.Isolation and phylogenetic analysis of bacteria with antimicrobial activities from the Mediterranean sponges Aplysina aerophoba and Aplysina cavernicola［J］.FEMS Microbiology Ecology，2001，35(3):305－312.

［4］聂亚锋，刘永锋，李德全，等.海洋细菌PY－sw－1产生的抗菌物质及其抗菌活性［J］.植物保护学报，2008，35(4):373－374.

［5］Wang Y F，Bao Y H，Shen D H，et al.Biocontrol of Alternaria alternata on cherry tomato fruitby use ofmarine yeast Rhodosporidium paludigenum Fell＆ Tallman［J］.International Journal of Food Microbiology，2008，123:234－239.

［6］Pusey P L，Wilson C L.Postharvest biological control of stone fruit brown rot by Bacillus subtilis［J］.Plant Disease，1984，68:753－756.

［7］Fox E M，Howlett B J.Secondary metabolism:regulation and role in fungal biology［J］.Current Opinion in Microbiology，2008，11:481－487.

［8］Kale S P，Milde L，Trapp M K，et al.Requriement of LaeA for secondary metabolism and sclerotial production in Aspergillus flavus［J］.Fungal Genetics and Biology，2008，45:1422－1429.

Inhibitory effect on the aflatoxin biosynthesis by a strain of marine Bacillus megaterium

KONG Qing1，LIU Qi－zheng1，GENG Juan2，WANG Xiu－dan1，YU Fang－tang1
(1.College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China;2.Inspection and Quarantine Technical Center of Shandong Exit＆ Entry Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao 266005，China)

TS201.3

A

1002－0306(2010)08－0132－03

2009－08－31

孔青(1979－)，男，博士，讲师，研究方向:农产品安全。

青岛市科技发展计划(081324jch);国家大学生创新性实验计划(081042309)。