王 兵，姜德友△，刘春红，柳成刚，郭加利，郭伟光，陈 强，江正龙，张海丽，王书惠

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；

2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001）

糖尿病心肌损伤系糖尿病（DM）常见慢性并发症之一，其病变可以是原发的，也可继发于冠状动脉供血障碍，且心肌病变出现较早，主要表现为心肌舒张和收缩功能障碍，易发生充血性心力衰竭。其确切的病理机制尚未彻底阐明，临床尚无特效药物，而中医药在防治该病方面很有潜力，但因其病理机制复杂，其状态的描述和中药复方多成分、多环节、多靶点的作用机制，又是传统单因素研究理论与方法难以解决的。为此，借助分子生物学研究方法，采用基因芯片技术，利用目前国际学术界公认的Affymetrix公司生产的Rat 2302.0基因芯片，寻找糖尿病心肌病相关基因，探讨糖尿病心肌病分子生物学机制，阐释中药复方糖心康治疗糖尿病心肌病的作用机理，对STZ诱导DM大鼠的心脏基因表达谱进行了研究，并对筛选出的差异表达基因用 Eve green实时荧光RT-PCR技术检测其在大鼠心脏组织中的含量及表达水平。本文仅报告糖心康对糖尿病心肌病大鼠心肌组织基因annexin A4 mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和药品

链脲佐菌素（STZ，CALBIOCHEM，USA）；糖心康为黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室制作；Rat 2302.0基因芯片（AFFYMETRIX，USA）。

1.2 动物造模及分组

Wistar雄性大鼠，体重200g～230g，除空白对照组外，余者以 25 mg·kg－1STZ左下腹腔注射，每天上午注射1次，连续5d。造模前12h禁食不禁水，造模1h后大鼠自由饮水、进食，造模1周后测血糖，血糖值在16.7mmol/L以上者皆认为造模成功。再随机分为模型组、治疗组，2组均喂以高热量饲料（高热量饲料由1％胆固醇、10％猪油、10％蛋黄粉、1％蔗糖、78％基础饲料制成）13周，共喂养26周。

1.3 给药方法

治疗组以中药糖心康灌胃，空白组及模型组以生理盐水灌胃。

1.4 标本采集

快速用180℃12 h处理过的手术剪刀摘取心脏，立即用预冷的生理盐水冲洗，冲洗后在冰上操作，沿心室长轴切取心肌置于液氮中冻存，以备提取RNA使用。

2 心肌组织差异表达基因的筛选

2.1 总RNA提取

从各组大鼠中取心脏，使用 QIAGEN's RNA easy Total RNA Isolation Kit抽提总 RNA，由纯化的总RNA合成双链 cDNA，经 PLG提取、乙醇沉淀将双链 cDNA纯化，用 BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit方法以生物素标记cRNA合成，QIAGEN Rneasy Columns法体外转录纯化生物素标记的cRNA，用分光光度计分析RNA浓度进行质控，凝胶电泳检测 IVT产物，片断化 cRNA，合成cRNA探针。

2.2 基因芯片的杂交、洗脱、染色及检测

合成好的cRNA探针经片段化处理后用于与基因芯片杂交。基因芯片为Affymetrix Rat 2302.0基因表达谱芯片，芯片的杂交、洗脱、染色及检测利用Affymetrix公司生产的专用设备“基因芯片检测工作站”（work station）进行，操作过程均按该公司推荐的条件进行。

2.3 基因芯片检测数据的处理

芯片扫描数据应用“Affymetrix Microarray Suite software 5.0”进行数据处理。

2.4 结果

筛选标准说明：差异基因筛选标准为change为I或 MI，ratio＞或 =1，实验组 Detection为 P的为上调基因，change为D或 MD，ratio＜或 =－1，对照组Detection为P的为下调基因。

散点图X轴为对照组信号值，Y轴为实验组信号值，图中红色点为实验组和对照组该基因的Detection均为 P，蓝色为2组中有1个值不是 P，而黄色点为2组均为A（图1）。

图1 a.模型组/空白组灰度扫描图；b.模型组/空白组散点图c.治疗组/模型组灰度扫描图；d.治疗组/模型组散点图

按照比较严格的条件筛选出差异表达基因，表达差异2倍以上的基因列表，包括基因名称、GenBank号、Uni号和染色体定位。其中，BM385237：annexin A4（anxa4），即膜联蛋白 A4，在糖尿病大鼠心肌组织表达下调，糖心康治疗组表达上调。

3 结果

3.1 空腹血糖、糖化血红蛋白水平变化

表1显示，实验结果表明，模型组大鼠空腹血糖（FBG）及糖化血红蛋白（HbA1C）水平明显升高，与正常组相比较，差异显著（P＜0.01），说明链脲佐菌素造模成功。治疗组较模型组有较大幅度降低，2组比较差异显著（P＜0.01），但较正常组仍高，说明糖心康有良好的降糖、减轻蛋白非酶糖基化的作用。

表1 各组空腹FBG、HbA1c水平比较±s）

表1 各组空腹FBG、HbA1c水平比较±s）

注：与正常组比较：*P＜0.01；与模型组比较：ΔP＜0.01

组 别 n FBG（mmol/L） HbA1c（％）正常组10 5.19±0.49 3.75±0.51模型组 10 20.53±3.55* 8.62±1.77*治疗组 10 10.74±2.54Δ 6.86±1.10Δ

3.2 心肌组织病理及超微结构变化

3.2.1 光镜下观察 图2～4显示，正常组：心肌纤维走行正常，无肥大，心肌细胞核呈圆形或椭圆形，居细胞中央，心肌间质及微血竹等结构正常。模型组：心肌纤维肥大，心肌纤维有大量灶性 PAS阳性物质沉积，心肌纤维出现散在或多处大小不等的局灶性、片状坏死；心肌毛细血管管腔狭窄、管壁增厚，有大量糖蛋白沉着、管壁内皮增生伴乳头状凸起，8周、15周、22周呈进行性加重。治疗组：心肌纤维肥大较轻，心肌内有少量PAS阳性物质沉积，心肌走行基本正常。

图2 正常组心肌HE染色（400×）

图3 模型组心肌HE染色（400×）

图4 治疗组心肌HE染色（400×）

3.2.2 电镜下观察 图5～7显示，正常组：心肌肌原纤维结构清晰，肌丝排列整齐，各带明显，细胞核发育良好，线粒体结构完好。呈圆形或椭圆形、嵴规则、无肿胀、变性等，线粒体及肌丝间糖原颗粒丰富正常，相邻心肌纤维处可见闰盘连接，心肌纤维间可见许多微血管，毛细血管基底膜无增厚。模型组：心肌肌原纤维走行紊乱，肌节破坏断裂，长短不一，肌丝灶性溶解、消失，肌浆网扩张，可见细胞核异形变。核周边有切迹，或固缩、染色质边集，亦可见核内空泡样变，核膜模糊断裂，核周细胞器呈点状、碎片状等变化，肌浆网囊状扩张，多数线粒体肿大，嵴断裂溶解，呈絮状、水鞘图样及空泡样变，线粒体膜下和基质内及核膜下电子密度增大（钙盐沉积），肌细胞线粒体间糖原散在，闰盘排列有断裂现象，坏死的心肌细胞附近可见成束的胶原结缔组织，成纤维细胞增生活跃。心肌细胞间可见少量吞噬细胞，毛细血管腔变窄甚至闭塞，内皮细胞肌膜断裂，核染色体边集，基底膜增厚。8周时心肌超微结构即出现异常改变，15周时加重，22周时病变更为严重。治疗组：心肌肌原纤维大都排列整齐，肌节发育良好，明暗带分明，未见肌丝溶解，肌浆网扩张减轻，细胞核发育良好，未见异形样变，核周有大量丰富的发育良好的线粒体，仍可见少量灶性絮状样变，未见钙盐沉积，肌丝及线粒体间糖元颗粒较丰富，闰盘排列紧密，肌细胞间可见增多的毛细血管。

3.3 荧光定量RT-PCR对心肌组织annexin A4 mRNA表达的检测

采用 Eve green 法，sense primer：5′-CAA ACA CAC GTG GTC TGC CTA-3′，length：21 bp，Tm 值：58℃；anti-sense primer：5′-TTG TAC CCT GCC ACC ATT TTC-3′，length：21 bp，Tm 值：58℃；product length：101 bp，product Tm 值：78℃ 。

3.3.1 RNA样品反转录 使用TAKARA公司的RNA PCR kit反转录试剂盒，按照试剂盒提供的反应体系进行反转录反应。反转录体系10 μL，30℃反应10 min，42℃反应30min～50min，95℃加热5 min，4℃反应5 min中止。

3.3.2 心肌组织 annexin A4 mRNA表达水平的检测结果 表2显示，在实时荧光定量PCR技术中，为了定量和比较的方便，引入荧光阈值（threshold）和 CT（threshold value）值的概念。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的1个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，CT值与起始模板的关系为每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。模型组大鼠心肌组织中 annexin A4 mRNACT值上调，说明annexin A4 mRNA在心肌组织表达量减少，与空白组比较差异显著（P＜0.05）。而经糖心康治疗后大鼠心肌组织中annexin A4 mRNACT值下调，说明糖心康能增加 annexin A4 mRNA在心肌组织的表达量，与模型组比较有显著差异（P＜0.05）。

表2 各组annexin A4 mRNA的表达水平比较

4 讨论

本研究以《金匮》治疗消渴病理法及相关论述为指导，并结合临床经验，根据该病气阴两虚血瘀网络式错综复杂的病变性质，主张随病证宜多法联用，从而确定了益气养阴活血为该病的主要治法，研制出中药复方糖心康，由太子参、黄芪、麦冬、玉竹、枸杞、丹参、土鳖虫等药组成。方中太子参与黄芪配伍，以增强益气之效，合枸杞、麦冬、玉竹共收益气养阴之功。丹参伍用土鳖虫增强活血化瘀之力。诸药相合，补而不滞腻，通而不伤正，滋而不助湿，温而不伤阴，共奏益气养阴、通络化瘀之效。

BM385237：annexin A4，膜联蛋白 A4（anxa4）。膜联蛋白家族（annexins）是一类与Ca2+结合后可进一步与膜磷脂结合的钙依赖性磷脂结合蛋白，迄今为止，从真菌、原生生物到植物、高等脊椎动物等超过65种不同种属范围内，已发现160种以上的annexins成员。在哺乳动物中有 12种，命名为ANXA 1-A 11、A 13，它们广泛存在于细胞质膜下、储Ca2+细胞器附近以及在核内或细胞外基质中。从免疫交叉反应及其蛋白质和cDNA序列分析结果证明，它们在结构上具有相似性，功能上也有许多相同点。Annexins家族都具有高度保守的C端中心结构域和独特的N末端。中心是由4～8个同源重复序列形成的一个略有弯曲、具有凹凸两面的盘状结构，每个重复序列由约70个氨基酸形成的5个a-螺旋连接成紧密的结构域。C端有蛋白水解位点、磷酸化位点以及与其他蛋白质结合的位点，是annexins的调节区域。Annexins各成员N端的序列长度各不相同，仅在蛋白激酶的磷酸化位点上序列相近。有实验证明，N端轻微改变不影响总体盘状结构，但在功能上影响凸面Ca2+依赖的磷脂结合功能，从而改变其分子生物学特征。目前针对annexins的生物学功能还只是一些初步研究，它们在细胞中发挥诸如抑制磷脂酶A2活性、参与细胞骨架活动、参与磷脂化与膜受体的功能调节、抗凝、传导有丝分裂信息以及促进细胞分泌等重要生物功能。对annexins早期研究主要集中在其参与炎症机理的反应方面。近年来，越来越多的研究发现，其在肿瘤的发生发展过程中可能发挥重要作用，如介导凋 亡、分 化 等。 且 以 annexinA1、annexinA2、annexin A5的相关报道较多，而中药复方对糖尿病状态下annexin A4调控研究未见专门报道。

膜联蛋白A4（anxa4）属于膜联蛋白家族，其基因定位于2p13，该蛋白广泛存在于动植物的各组织器官，约占细胞内蛋白质总量的2％。其是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，具有磷脂酶抑制因子、与钙离子结合、与钙依赖磷脂结合的活性，可促进膜融合，参与囊胞运输、钙离子通道形成、细胞骨架活动、磷脂化与膜受体的功能调节以及胞吞、胞吐和分泌等重要生物学功能。新近文献报道，annexins A4可能具有调节细胞生长分化、细胞凋亡等多种生物学功能，而这些生物学行为失调可能与糖尿病心肌损伤的发生具有较强的相关性。有研究证明，annexins A4可以抑制细胞内Ca2+水平升高，维持细胞内Ca2+水平的稳定，从而避免心肌收缩功能异常，同时还可能增强细胞对凋亡的抵抗能力。

本实验基因芯片结果显示，annexins A4在糖尿病状态心肌组织表达下调，提示糖尿病心肌病的发生可能与annexins A4的基因调控有关，其机制可能在于：（1）钙调控失衡引起心肌收缩功能异常，导致或加重糖尿病性心肌病大鼠心肌损伤；（2）不利于心肌细胞骨架结构的形成；（3）心肌细胞生长、分化或凋亡异常导致心肌损伤。

本实验结果表明，糖尿病性心肌病时 annexins A4 mRNA呈低表达，而应用中药复方糖心康后，annexins A4 mRNA表达上调，说明糖心康可通过上调糖尿病大鼠心肌组织annexins A4 mRNA的表达，保护心肌组织，延缓疾病进一步发展。