高江婧, 严群, 阮文权＊

(1.江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122;2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122;3.江南大学环境与土木工程学院,江苏无锡 214122)

一株产L-乳酸菌株的筛选、鉴定及营养条件的初步研究

高江婧1, 严群2,3, 阮文权＊2,3

(1.江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122;2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122;3.江南大学环境与土木工程学院,江苏无锡 214122)

作者对筛选的一株产L-乳酸的菌株进行了菌种鉴定,根据16S rDNA序列测定结果,结合其形态特征及生理生化性质,确定该菌株为凝结芽孢杆菌(B acillus coagulans)。进一步对其营养条件进行了研究,初步确定玉米糖化液为最适碳源,采用1 g/dL酵母粉与1 g/dL棉籽蛋白的混合氮源,L-乳酸产量不仅有所提高且成本大大降低,金属离子Mn2+、Fe2+、Mg2+都可在一定程度上提高L-乳酸的产量。

细菌鉴定;16S rDNA;凝结芽孢杆菌;L-乳酸

乳酸是目前世界上公认的3大有机酸之一,广泛应用于食品、医药、化工、制革、纺织、环保和农业等诸多领域[1]。特别是以L-乳酸为原料生产的生物可降解性塑料——聚乳酸,对于解决日益严重的白色污染问题有重要的意义。近年来关于L-乳酸的研究报道很多,发酵法生产L-乳酸的菌种主要有根霉和细菌两大类。与根霉好氧发酵生产L-乳酸相比,乳酸细菌发酵法具有糖转化率高、无通气能量消耗、成本低等优点[2]。因此筛选L-乳酸产生菌具有重要意义。

目前文献报道细菌乳酸发酵的较高水平有赵博等人[3]以葡萄糖为碳源,添加豆粕水解液和玉米浆作为辅料,2 L罐培养120 h,L-乳酸质量浓度可达202 g/L,糖转化率91.3%。丁绍峰等[4]采用指数流加发酵使总乳酸质量浓度达210 g/L,其中L-乳酸质量浓度达180 g/L。虽然产量很高,但仍存在发酵周期长、生产效率低或光学纯度低等缺点。作者对实验室分离出的一株产L-乳酸的菌株进行了生理生化试验、糖发酵试验及16S rDNA序列测定,确定该菌株为凝结芽孢杆菌。为进一步了解该菌株发酵生产L-乳酸的能力,对其营养条件进行了初步研究。由于乳酸细菌发酵法对氮源的要求较高,从而使生产成本偏高,因此降低氮源的成本具有很大的现实意义,作者亦在降低氮源成本方面做了尝试。

1 材料与方法

1.1 菌种的筛选与鉴定

1.1.1 菌种的筛选 采集某奶制品企业附近离地面约3～10 cm的土样,样品经增殖、稀释后涂布CaCO3-溴钾酚紫平板培养基,待长出菌落后,挑选可水解CaCO3且变色圈大的菌株,经摇瓶发酵后,选取L-乳酸产量高且光学纯度高的菌株并将其保藏。

1.1.2 菌体形态观察及生理生化实验 参照文献[5]。

1.1.3 糖类发酵实验 参照文献[6]。

1.1.4 分子生物学鉴定 染色体DNA的提取,菌株16S rDNA的扩增、16S rDNA序列的测定以及BLAST比对均参照文献[7]。

1.2 培养基

1.2.1 分离平板培养基 CaCO3-溴钾酚紫平板培养基。

1.2.2 摇瓶种子培养基与摇瓶发酵培养 参照文献[8]。

1.3 培养方法

1.3.1 种子培养 从培养24 h的斜面上挑取一环菌体接入液体种子培养基,45℃、120 r/min摇床培养18 h。

1.3.2 发酵培养 将培养良好的种子按体积分数10%接种于发酵培养基中,45℃、120 r/min摇床培养72 h。

1.4 分析方法

1.4.1 乳酸质量浓度 采用高效液相色谱仪(Agillent 1100,美国)。具体色谱条件:色谱柱为美国Merck公司的ZORBAXSB-Aq,150 mm× 4.6 mm(直径5μm),流速0.5 mL/min,检测波长210 nm,进样量10μL,柱温30℃。

1.4.2 L-乳酸质量浓度 用SBA-40C生物传感分析仪测定。L-乳酸质量浓度与乳酸总质量浓度之比即为L-乳酸的光学纯度。

1.4.3 残糖质量浓度 DNS法。

2 结果与讨论

2.1 菌株的鉴定结果

经初筛得到42株产酸圈较大的菌株,经摇瓶试验后得到菌株ES23,其L-乳酸产量最高,达到47.74 g/L,且光学纯度达到99.3%,选择该菌株做进一步研究。由图1可知,菌株在平板上的单菌落呈圆形,稍透明,边缘整齐,菌落呈乳白色,菌落直径约为2.0～2.5 mm。在光学显微镜下观察可知,菌体为杆状,少数稍弯曲,单个排列,长约3.0～5.0 μm。细菌革兰氏染色呈阳性。在一定条件下可产生芽孢,为端生。无鞭毛,能运动,为兼性厌氧菌。

图1 菌落形态Fig.1 Colony shape

将试管中斜面培养保藏的菌株活化3代后接种到生化试验培养基中,培养后测定其生化特性。结果见表1。菌株对不同碳水化合物的利用情况见表2。

由表1生理生化特性的测定结果可知,该菌株过氧化氢酶为阳性,VP阳性,明胶液化阴性,可分解利用淀粉。由表2可知,该菌株能利用大多数寡糖,包括纤维二糖和菊粉,但不能分解利用木糖和鼠李糖。同时做了产气实验,结果均不产气。此外,糖类发酵实验中添加了指示剂溴甲酚紫,若菌株能利用某种糖,培养基颜色可由紫变黄,根据变色时间的长短可判断分解某种糖的快慢程度。实验发现,该菌能迅速利用葡萄糖、麦芽糖、果糖、半乳糖和糊精;而需要较长时间才能分解乳糖、蔗糖、纤维二糖、菊粉和淀粉。

表1 菌株的生理生化实验结果Tab.1 Results of physiological and biochemical characteristics

表2 菌株对不同碳水化合物的利用情况Tab.2 Utilize ability of carbon source

所测菌株的16S rDNA核苷酸序列为1 464 bp。将所测序列从GenBank数据库中相关菌种进行比较,结果表明:该菌株与芽孢杆菌属B acillus coagulans具有极高的同源性,为99%。结合以上生理生化结果,参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[9]分析比较,其生理生化指标均相同,可确定该菌株为凝结芽孢杆菌。该菌种在利用五碳糖方面与研究报道不相一致。Milind A[10]报道其分离的凝结芽孢杆菌可利用分解利用木糖发酵产乳酸,而该菌株不能分解利用五碳糖。

2.2 碳源对发酵产酸的影响

实验选取葡萄糖、玉米糖化液、马铃薯淀粉糖化液,木薯糖化液,菊粉作为发酵培养基的碳源,其中初糖质量浓度为90 g/L,氮源为酵母粉与蛋白胨。并且,玉米淀粉、马铃薯淀粉及木薯粉均采用高温淀粉酶及α-糖化酶进行双酶水解。由图2可知,葡萄糖和玉米糖化液的L-乳酸产量最高,分别为49.62 g/L和49.25 g/L,其次为马铃薯淀粉糖化液、木薯糖化液和菊粉。前期研究发现,该菌株可分解利用非粮作物菊粉,但几乎不产L-乳酸,仅可从液相图谱中检测到乙酸、琥珀酸等杂酸。由此说明,葡萄糖是使代谢途径大量积累乳酸的最佳碳源,考虑到成本,作者选用玉米糖化液为碳源。

图2 不同碳源对L-乳酸发酵的影响Fig.2 Effect of different carbon sources on L-lactic acid production

为确定碳源初始水平,以玉米糖化液为碳源,考察其对该菌株发酵生产L-乳酸的影响,结果见图3。

图3 碳源质量浓度对L-乳酸发酵的影响Fig.3 Effect of concentration of glucose acid production on L-lactic acid production

当初糖质量浓度低于120 g/L时,随着初糖质量浓度的增大,L-乳酸产量依次增大;当初糖质量浓度高于120 g/L时,L-乳酸产量下降,较高的底物质量浓度会使培养基渗透压增大,导致菌体不能很好的生长和产酸。初糖质量浓度为105 g/L和120 g/L时,乳酸产量相差不大,分别为58.87 g/L和60.07 g/L,而后者糖的转化率相对较低。因此最佳的碳源质量浓度为105 g/L。

2.3 氮源对发酵产酸的影响

实验选取了一些常见氮源,包括酵母粉、蛋白胨、牛肉膏等优质有机氮源,还包括一些廉价氮源,有豆饼粉、麦根、玉米浆、棉籽蛋白,发酵结果见图4。从图4可以看出,所有氮源中,酵母粉单独作为氮源时,L-乳酸产量最高,为52.03 g/L,这可能与酵母粉中富含丰富的氨基酸和维生素等生长因子有关。在廉价氮源中,玉米浆单独做氮源时L-乳酸产量相对较高,为18.24 g/L。用牛肉膏单独做氮源时,在所稀释范围内未检测到L-乳酸,但从液相色谱图中可以检测到较多的丙酮酸、乙酸以及琥珀酸。由此可说明,营养环境条件的变化对该乳酸菌的代谢途径改变很大。

图4 不同氮源对L-乳酸发酵的影响Fig.4 Effect of nitrogen source on L-lactic acid production

虽然使用酵母粉单独做碳源时L-乳酸产量最高,但相比其他氮源来说,酵母粉价格高昂,这将严重阻碍乳酸的大规模工业化生产。为减少成本,设计了几组不同的氮源组合,将酵母粉与一些廉价氮源混合发酵,结果见表3。

表3 复合氮源对L-乳酸发酵的影响Tab.3 Effect of mixed nitrogen sources on L-lactic acid production

由表3可知,在廉价氮源中,玉米浆单独作氮源时L-乳酸产量较高,但与酵母粉混合后产量反而降低。豆饼粉、棉籽蛋白以及大豆蛋白胨单独做氮源时,L-乳酸产量很低,但与酵母粉混合后,产酸量都得到了较大的提高,说明这3种氮源的营养成分与酵母粉的生长因子起到了很好的相互补充的作用。L-乳酸产量随酵母粉添加量的增加而升高,其中大豆蛋白胨与酵母粉混合后,当酵母粉添加量由0.5 g/dL增加到1 g/dL时,L-乳酸产量增加了近3倍。虽然1 g/dL酵母粉与0.5 g/dL大豆蛋白胨混合后产酸量最高,为73.06 g/L,但大豆蛋白胨价格相比豆饼粉和棉籽蛋白来说仍较高,因而氮源应选取1 g/dL酵母粉与1 g/dL棉籽蛋白,其产酸量为60.89 g/L,此时L-乳酸产量不仅有所提高且成本降低。

2.4 金属离子对发酵产酸的影响

微生物在生长繁殖和产物合成中都需要无机盐和一些微量元素,这些物质在较低的质量浓度时会促进菌体的生长和产酸,而在高质量浓度时常表现出显著的抑制作用。作者考察了MnSO4·H2O, FeSO4·7H2O及MgSO4·7H2O对L-乳酸发酵的影响。结果见表4。由表4可知,Mn2+、Fe2+、Mg2+都可在一定程度上提高L-乳酸产量,其最佳质量浓度分别为0.05,0.04,0.6 g/L。

表4 金属离子对L-乳酸发酵的影响Tab.4 Effect of metal ions on L-lactic acid production

3 结 语

作者对实验室分离出的一株产L-乳酸的菌株进行了生理生化试验、糖发酵试验、16S rDNA序列测定,确定该菌株为凝结芽孢杆菌。为进一步了解该菌株生产L-乳酸的能力,对其营养条件进行了研究,初步确定玉米糖化液为最适碳源,其最佳质量浓度为105 g/L;复合氮源中1 g/dL酵母粉和0.5 g/dL大豆蛋白胨L-乳酸产量最高;而1 g/dL酵母粉与1 g/dL棉籽蛋白混合后产酸量虽较前者有所降低,但成本已大大降低。金属离子Mn2+、Fe2+、Mg2+都可在一定程度上提高L-乳酸产量。

采用该菌株发酵生产L-乳酸的产量虽不及当前国内外所报道的产量,但该菌有很多优点,如该菌株光学纯度高,产芽孢可使保藏容易,发酵温度较高可耐高温发酵,并且培养基可以在未灭菌的条件下发酵,这将节约因灭菌而消耗的能量,从而降低发酵成本。若对该菌株进行菌种改造,或通过发酵过程优化、代谢流量控制等措施来进一步提高其合成L-乳酸的能力,那么该菌将是很有潜力的一株发酵生产L-乳酸的菌株。

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(责任编辑:李春丽)

Screening,Identification of a Bacteria Strain for the Production of L-lactic Acid

GAO Jiang-jing1, YAN Qun2,3, RUAN Wen-quan＊2,3
(1.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;3.School of Environmental and Civil Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

A bacteria strain was isolated and identified for L-lactic acid production in this study, The isolated strain was identified asB acillus coagulansbased on the results of 16S rDNA,the physiological characteristicsandthebiochemicalproperties.Thentheoptimumnutrient conditions was determined by the single factor experiments and list as fellows:10.5 g/dL corn syrup,1 g/dL yeast extract,1 g/dL cotton-seed protein.Furthermore,it was found that the presence of Mn2+、Fe2+and Mg2+in the medium can enhance L-lactic acid production.

identification,16SrDNA,B acillus coagulans,L-lactic acid

TQ 920.1

:A

1673-1689(2010)03-0453-05

2009-03-12

江苏省科技支撑-社会发展项目(BE 2008607)。

＊通讯作者:阮文权(1966-),男,上海人,工学博士,教授,博士生导师,主要从事环境生物技术方面的研究。Email:wqruan@jiangnan.edu.cn。