姜海荣, 倪永清, 宋丽军, 尹琳琳, 江英, 陈计峦

(新疆石河子大学食品学院,新疆石河子 832003)

新鲜哈密瓜汁中可培养细菌的分离鉴定及系统发育分析

姜海荣, 倪永清, 宋丽军, 尹琳琳, 江英, 陈计峦＊

(新疆石河子大学食品学院,新疆石河子 832003)

采用稀释平板法从新鲜哈密瓜汁中分离出48株可培养细菌,通过传统的形态特征鉴定,将其归为10个类群。利用细菌通用引物PCR扩增10个类群代表菌株的16S rRNA基因,并进行序列测定。将获得的序列通过Blast在GenBank数据库中搜索相关菌株的同源性序列,采用Clustal1.81软件比对,用Mega 4.1软件构建系统发育树。系统发育分析结合表型特征研究表明,新鲜哈密瓜汁中可培养细菌以芽孢杆菌属为优势微生物类群,主要为枯草芽孢杆菌B acillus subtilis,其次为地衣芽孢杆菌B acillus lichenif ormis、苏云金芽孢杆菌B acillus mojavensis。此外还有铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、洋葱伯克霍尔德氏菌B urkholderia cepaciastrain、鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumannii,以及肠球菌属Enterococcussp、克雷伯氏菌属Klebsiellasp的菌株。

新鲜哈密瓜汁;可培养细菌;16S rDNA;序列分析;系统发育分析

新疆哈密瓜风味独特、富含多种营养物质,其果汁为金黄色,处于均匀的混合状态,是一种很有市场潜力的果汁。但哈密瓜是热敏性瓜果,采用传统的高温杀菌,将使哈密瓜汁产生不良的蒸煮味,且失去大量营养物质,因此对于热敏性的果蔬汁多采用非热力杀菌模式。研究表明[1],引起果汁腐败变质的因素很多,如微生物、酶类等,但是引起新鲜果汁腐败变质的主要因素是微生物污染。

为了选择合适的杀菌方式,更有效地控制哈密瓜汁中微生物,就必须首先了解哈密瓜汁中的常见微生物的种类、特性和数量分布状况,然后才能有针对性地选择适宜的杀菌方法和杀菌工艺。因此对新鲜哈密瓜汁中的微生物种类进行分离和鉴定,对如何控制新鲜哈密瓜汁中微生物具有非常重要的意义。

果汁中的微生物菌群相对复杂,按照传统的以形态学和生理生化指标为基础的细菌检测和分类方法较为繁琐。目前随着分子生物学的发展,采用16S rRNA基因鉴定未知菌更加方便、快捷、高效。因此16S rRNA已经成为细菌系统分类研究中最常用也是最有效的分子指标,被广泛地应用于各种微生物的遗传特性和分子差异的研究[2]。作者在研究新鲜哈密瓜汁中的可培养细菌基本生长特性的基础上,采用细菌通用引物对分离菌株的16S rRNA基因进行扩增和快速鉴定,以确定哈密瓜汁中微生物类群的多样性,为哈密瓜汁的有效杀菌和贮藏提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌种及仪器设备

1.1.1 材料 新疆哈密瓜,品种为伽师瓜86-1,产于新疆喀什市,其新鲜哈密瓜汁p H值为6.55。

1.1.2 菌种 分离自新鲜哈密瓜汁中的可培养细菌。

1.1.3 仪器设备 SW-CJ-100型超净工作台,苏净集团安泰公司制造;DNP-9272型电热恒温培养箱:上海精宏实验设备有限公司制造;SPX-250B-2型生化培养箱:上海博远实业有限公司制造;TC-512型PCR仪:Barloworld公司制造;Gel DoxTMXR 170-8170型凝胶成像系统:Blo-RAD公司制造。

1.2 培养基

1.2.1 LB固体培养基: 胰蛋白胨10 g,酵母膏5 g,氯化钠10 g,琼脂17 g,调p H 7.0,定容至1 000 mL,121℃高压灭菌20 min。

1.2.2 营养肉汤培养基(NA) 蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,氯化钠5 g,琼脂17 g,调p H 7.2,定容至1 000 mL,121℃高压灭菌20 min。

1.2.3 营养琼脂肉汤培养基(NB) 蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,氯化钠5 g,调p H 7.2,定容至1 000 mL,121℃高压灭菌20 min。

1.3 细菌的分离、纯化及保存

100个哈密瓜随机分为5组,每组随机选取一个,瓜体表面经过酒精消毒,去皮去瓤,在无菌超净台将哈密瓜切成1 cm小块放入无菌培养皿,再用无菌玻板捣碎,静置10 min,吸取1 mL新鲜瓜汁接入9 mL无菌生理盐水,即得10-1浓度菌悬液,依次类推,分别制取10-2、10-3浓度菌悬液。稀释平板法分离哈密瓜汁中可培养细菌。

取菌落数在30～300个之间而且菌落之间分离生长较好的平皿,无菌操作挑选不同形态和颜色的菌落,在NA培养基上进行平板划线分离,将此平皿置37℃恒温箱内培养2～4 d,挑取的菌落经3～5次的平板划线分离后,如果菌落形态、颜色较一致,则进行革兰氏染色后镜检,经过分离得到的单菌落进行涂片和简单结晶紫染色,在1 000倍光学显微镜下观察观察其形态和纯度[3],不纯的菌落用平板稀释法进行纯化,分离纯化后在4～6℃下保存。另一份纯化后的单菌落接入营养肉汤培养培养基,37℃摇床培养后加入体积分数15%的甘油,于-80℃超低温冰箱中保存。

1.4 革兰氏染色和镜检

取菌种培养物常规涂片,用结晶紫进行染色,再用碘液媒染,然后用乙醇脱色,最后用番红复染。在显微镜下观察个体形态特征,如果发现还有杂菌,则继续进行平板划线分离,直至镜检个体形态特征一致。镜检中细胞保留蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌,细胞为红色的细菌为革兰氏阴性。

1.5 芽孢检测

分离出的菌株分别编号为s-5-2,B-1,s-4,s-5-1,A-1,AAM-1,AAM-2,S-2,s-3,B-2,接种到NA平板上,30℃培养3～7 d,显微镜观察是否有芽孢形成。

1.6 生长温度范围和pH值范围的测定

分离的菌株编号为s-5-2,B-1,s-4,s-5-1,A-1,AAM-1,AAM-2,S-2,s-3,B-2。

1.6.1 生长温度范围 为准确测定温度范围[4],采用下面两个步骤:

1)粗测:首先将以上编号的菌悬液以涂布法涂布在p H为7.0的NA培养基平板上,将平板分别在温度为20、30、40、50、60、70℃条件下恒温培养48 h后观察菌落生成情况,初步确定各菌生长温度范围。

2)精测:确定大致范围,再将以上编号的菌悬液以涂布法涂布在p H为7.2的NA培养基平板上,使其温度值在粗测的范围内精确到0.1,将平板分别在不同的温度下恒温培养48 h,观察菌落生成情况,最终确定各菌生长温度范围。

1.6.2 不同菌生长p H值范围的确定

1)粗测:分别采用1%的稀硫酸,1%的氢氧化钠溶液来调整NA培养基的p H值,使其p H值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,将不同编号菌悬液以涂布法分别涂布在不同p H值的NA培养基上,37℃下培养48 h后观察菌落生成情况,初步确定耐热菌的生长p H值范围。

2)精测:经初步确定,将耐热菌菌悬液以涂布法分别涂布在不同p H值的NA培养基上,使其p H值在粗测的范围内精确到0.1,37℃下培养48 h后观察菌落生成情况,最终确定不同菌的生长p H值范围。

1.7 细菌菌株的16S rDNA鉴定

1.7.1 细菌培养及染色体DNA制备 接种单菌落于5 mL LB培养基中,37℃培养过夜。然后取1 mL培养液接入100 mL LB培养基中,37℃、220 r/min培养24 h,5 000 r/min离心15 min,弃上清液,加入无菌水离心洗涤,弃上清液,再加入10 mL TE离心洗涤,弃上清液,加入10 mL TE溶解菌体,混匀于-20℃保存备用。

取0.5 mL菌悬液加入30μL SDS混匀,加入10μL 20 mg/mL蛋白酶K,10μL溶菌酶,37℃混匀温育1 h。加入100μL、5 mol/L NaCl,再加入80μL CTAB/NaCl溶液混匀,65℃温育10 min,加入等体积V酚∶V氯仿∶V异戊醇为25∶24∶1,混匀于12 000 r/min离心5 min,保留上清液,上清液中加入等体积V酚∶V氯仿∶V异戊醇为25∶24∶1混匀, 12 000 r/min离心5 min,保留上清液,上清液中加入氯仿/异戊醇,12 000 r/min离心5 min,保留上清液。上清液中加入无水乙醇和醋酸钠,轻轻混合直到DNA沉淀下来,冷藏过夜,12 000 r/min离心5 min,收集沉淀,用70%乙醇离心洗涤沉淀,用1 mL TE溶解DNA,加入20μg/mL RnaseA于4℃保存。

DNA电泳检测:用1 g/dL琼脂糖凝胶(含核酸染液),每孔点样6μL(5μL样品+1μL loading butter),电泳为100 V/h。

1.7.2 16S rDNA基因的PCR扩增和产物纯化目前根据大肠杆菌的基因组序列设计出了多对用于16S rDNA序列扩增的引物。作者选择引物为27f 5-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3对应于E.coli16S rDNA的8～27位和1492r 5-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3,对应于E.coli16S rDNA的1 525～1 542位进行扩增,该对引物能够扩增出近乎全长的16S rDNA序列,长度约为1 500 bp。

50μL16S rDNA-PCR的反应体系:16S rDNAPCR的反应体系:10×的Taq Buffer 5μL,2.5 mmol/L dNTP 4μL,2.5 U Taq酶0.2μL,0.4 μmol/L的引物1μL,模板约500 ng/μL,2 mmol/L MgCl24μL,使用超纯水将反应体系补至50μL。

热循环参数设置为:95℃预变性4 min,94℃变性1 min,55℃复性1 min,72℃延伸2 min,30个循环;72℃延伸7 min。取3～5μL扩增产物于1 g/dL的琼脂糖凝胶上电泳,利用凝胶成像系统成像。

1.7.3 PCR产物的测序及结果分析 PCR产物通过切胶纯化,样品送至上海生工公司双向测序,将拼接后的测序结果输入http://www.ncbi.nlm. nih.gov/,通过互联网,将测得的基因序列,通过Blast程序与GenBank数据库中相似性较高的相关菌株的16S rRNA基因序列进行同源性分析。

序列的比较及系统发育分析采用Clustalx1.81软件与GenBank基因序列作最大同源性比较分析,并利用Mega 4.1软件以N-J法(neighbor-joining)作系统树,并构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 16S的rDNA-PCR产物纯化电泳检测

PCR产物纯化,经电泳后利用小源凝胶成像系统成像,见图1。与Maker条带比较,可知目标扩增产物的片段长度大约为1 500 bp。图1标号为1～10,分别为s-5-2、B-1、s-4、s-5-1、A-1、AAM-1、AAM-2、S-2、s-3、B-2的16S rDNA-PCR产物纯化电泳图。

图1 不同分离自新鲜哈密瓜汁中菌株16SrDNA-PCR产物纯化电泳图谱Fig.1 Diagram of Agarose gel electrophoresis of strains isolated from freah H ami-melon juice by 16S rDNA-PCR

2.2 形态特征、基本生长特征及序列分析

不同编号菌株的形态特征、基本生长特征及序列分析结果见表1。

根据与Genebank中已有的核酸序列比较结果,除s-3和B-2菌株外,其余8株菌与数据库中同一种的细菌同源性均大于99%。一般认为,16S rDNA序列同源性小于98%,可以认为属于不同的种,同源性小于93%～95%,可以认为属于不同属[5]。因此s-5-2、s-4、B-1可以确定为枯草芽孢杆菌B acillus subtilis,AAM-1可以确定为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosastrain,AAM-2可以确定为洋葱伯克霍尔德氏力B urkholderia cepacia,S-2可以确定为鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumanniistrain,A-1可以确定为苏云氏芽孢杆菌B acillus mojavensisstrain,s-5-1可以确定为地衣芽孢杆菌B acillus lichenif ormisstrain,s-3和B-2分别可以确定为肠球菌属Enterococcus和克雷伯氏菌属Klebsiella。其中s-3与粪肠球菌同源性高达97%,有可能与其是一个种。B-2可能属于克雷伯氏菌属的某个新种。

2.3 16S rDNA序列的系统发育分析

将各代表菌株和应用Blast检索到的与之有较高同源性菌株的16S rDNA序列利用Clustalx1.81软件与GenBank基因序列作最大同源性比较分析,并利用Mega 4.1软件以N-J法(neighbor-joining)作系统树,并构建系统发育树,确定菌株的分类地位。在图2中,A-1、s-5-1、s-5-2、B-1、s-4亲缘关系非常近,与s-3较近,基本属于同一属的范围内,而与AAM-1,AAM-2,S-2,B-2亲缘关系非常远。

图2 新鲜哈密瓜汁中分离菌株序列系统发育分析(NJ)Fig.2 Neighbor-joing tree constructed showing the phylogenetic relationships among 16SrRNA gene sequences of isolated from H ami-melon juice.The scale bar represent 0.05 substitution

3 讨 论

基于当今分子生物学技术迅速的发展,越来越多的研究者开始使用16S rDNA序列分析方法[6]。作者采用传统方法将所有分离到的菌株作初步的形态观察和生理学检测,将分离到的48株菌分为10个类群,应用16S rDNA作为分子指标,扩增出未知菌的16S rDNA,纯化测序,测序结果在Genbank中用Blast比对分析发现,从哈密瓜汁分离的不同菌株,大部分与已知菌都有很高的同源性,且能达到鉴定种的水平,很少可能有新种。

作者从新鲜哈密瓜汁中分离的48株可培养细菌,其中分离芽胞菌比例最大,占分离菌株的60%,为哈密瓜汁中主要的菌群。芽孢杆菌属如枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌,在缺氧或不利条件下形成芽胞,是食品中常见的一种污染菌,在传统的发酵制品中污染几率更大[7]。一般而言,耐热的细菌同样耐压,枯草芽胞杆菌比嗜热脂肪芽胞杆菌(B acillus stearothemophilus)更耐压[8-9]。陈世琼等[10]人对苹果汁中酸耐热菌的分离鉴定为苹果汁的非热力杀菌技术提供了研究方向。

由于芽胞菌为哈密瓜汁中主要的菌群,在选择哈密瓜汁杀菌方式时,应考虑该菌群的杀灭程度对果汁品质本身可能造成的影响,因此该研究可为后续研究超高压处理哈密瓜汁的杀菌工艺提供更为可靠的依据。

[1]ZHANG X,SUN A D,GE Y Q,et al.Concentrated fruit juice and its post-turbidity[J].Food Sci Technol,1997,5:28-30.

[2]龙雯,陈存社.16S rRNA测序在细菌鉴定中的应用[J].北京工商大学学报,2006,24(5):10-12.

LONG Xia,Chen Cun-she.16S rRNA sequence employed in identification of bacteria[J].Journal of Beijing Technologyand Business University(Natural Science Edition),2006,24(5):10-12(in Chinese).

[3]闫旭,马忠良,阮文权.一株硫化物氧化细菌的分离、鉴定和脱硫效果初步验证[J].食品与生物技术学报,2008,27(5): 113-116.

YAN Xu,MA Zhong-liang,RUAN Wen-quan.Screening,identification and sulfur removal ability validating of a suifide-oxidizing strain[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2008,27(5):113-116.(in Chinese).

[4]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.

[5]曾润颖,赵晶.深海细菌的分子鉴定分类[J]微生物学通报,2002,29(6):12-15.

ZENG Run-ying,ZHAO Jing.Molecular identification and classification of deep seaPsychrophilicbacteria from East-Pacitic sediment[J].Bulletin of Microbiology,2002,29(6):12-15.(in Chinese)

[6]Delong E F,Wickham G S,Pace N R.Phylogenetic stains:ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells[J].Science,1982,243:1360-1363.

[7]曾庆梅.超高压灭活枯草芽抱杆菌(AS 1.140)的参数优化[J].农业工程学报,2005,21(4):158-162.

ZENG Qing-mei.Optimization of ultra-high pressure proceessing parameters on surviors ofBacillus subtilisAS1.140[J]. Journal of Agriculture and Engineering,2005,21(4):158-162(in Chinese)

[8]Nakayama A,Yano Y,Kobayashi S,et al.Comparison of pressure resistances of spores of sixBacillusstrairns with their heat resistances[J].Appl Enviro Micro Biro,1996,62:3897-3900.

[9]Sojka B,Ludwig H.Effect of pressure changes on the inactivation ofBacillus subtillusspores[J].Pharm Ind,1997,59: 436-438.

[10]陈世琼,陈文峰,胡小松,16S rDNA PCR-RFLP法快速鉴定分离自浓缩苹果汁生产线的脂环酸芽孢杆菌[J].中国食品学报,2006,6(2):99-102.

CHEN Shi-qiong,CHEN Wen-feng,HU Xia-song.Isolation and characterization of thermo-acidophilic endospore-forming bacteria from the concentrated apple juice-processing environment[J].Journal of China Food,2006,6(2):99-102.(in Chinese).

(责任编辑:李春丽)

Identification and Phylogenesis Analysis of Cultivable Microorganism Isolated from Fresh Hami-Melon Juice

J IANG Hai-rong, NI Yong-qing, SONG Li-jun, YIN Lin-lin,
J IANG Ying, CHEN Ji-luan＊
(College of Food Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

Forty-eight strains were isolated from the fresh hami melon juice using the dilution plate method.Those isolated strains divided into ten groups according to the morphological features. Then the 16S rDNA sequences were performed by employing the universal prime bacterial for polymerase chain reaction(PCR)amplification.The alignment search was performed with BLAST and GenBank databases,then compared this sequences using the software of Clastal1. 81,the phylogenetic tree was built using Mega 4.1 software.From the phylogenetic tree,it could be concluded thatB acillus subtilisis the main cultivated bacteria in the fresh hami melon juice and the following isB acillus lichenif ormis,B acillus mojavensis,Pseudomonas aeruginosastrain RE7,B urkholderia cepaciastrain ATCC 21809,Acinetobacter baumannii,andEnterococcussp,Klebsiellasp.

fresh hami melon juice,cultivate bacteria,16S rDNA,sequence analysis,phylogenetic

TQ 920.1

:A

1673-1689(2010)03-0426-06

2009-09-07

教育部重点项目(207137);兵团博士基金项目(2007jc11);国际科技合作项目(2009DFA32160)。

＊通信作者:陈计峦(1973-),女,新疆石河子人,工学博士,副教授,硕士生导师,主要从事农产品加工与贮藏方面的研究。Email:chenjiluan@163.com。