孙涛, 银旭红, 谢晶, 李立, 赖克强, 周冬香

(上海海洋大学食品学院,上海 201306)

取代度相同的N-酰化低聚壳聚糖清除自由基作用的研究

孙涛, 银旭红, 谢晶, 李立, 赖克强, 周冬香

(上海海洋大学食品学院,上海 201306)

低聚壳聚糖经N-酰化得到取代度相同的N-马来酰低聚壳聚糖和N-邻苯二甲酰低聚壳聚糖,其取代度均为0.25。用红外光谱对其结构进行表征,凝胶色谱测定其相对分子质量大小。并考察了其对羟基自由基(.OH)和1,1-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH)的清除能力。结果表明:取代度相同,N-邻苯二甲酰低聚壳聚糖对.OH、DPPH的清除能力优于N-马来酰低聚壳聚糖。这说明取代度相同时,取代基的结构会影响N-酰化低聚壳聚糖对自由基的清除活性。

低聚壳聚糖;N-酰化;抗氧化;取代度

自由基引起的氧化对机体具有巨大的损伤作用,如引起蛋白质损伤、酶失活、导致衰老、肿瘤、动脉硬化等多种疾病[1-2]。因此筛选高效的活性氧清除剂具有重要的意义。低聚壳聚糖是壳聚糖的降解产物,其分子单元结构中有大量的氨基和羟基,具有良好的抗氧化性[3-5],同时也决定了它可以进行多种化学改性。N-酰化改性是低聚壳聚糖的一种重要改性方式,研究报道N-酰化壳聚糖具有良好的吸湿保湿和抑菌作用[6-7],但是其抗氧化性,尤其是其N-取代基结构和取代度与其抗氧化性能之间的关系还尚未见报道。作者通过制备取代度相同的N-马来酰和N-邻苯二甲酰化低聚壳聚糖,通过考察其对羟基自由基·OH和DPPH的清除活性,研究了取代基团的结构对N-酰化低聚壳聚糖的抗氧化活性的影响,为低聚壳聚糖衍生物抗氧化性能的进一步研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

低聚壳聚糖,购自浙江金壳生物化学有限公司(凝胶色谱测定其相对分子质量为5 000 000);鲁米诺,DPPH,购自Sigma公司;其余试剂均为分析纯,购自上海化学试剂公司;磁力搅拌器,p H计,分光光度计,电导率仪,EQUNOX55傅立叶红外-拉曼光谱仪,Waters 515型凝胶色谱仪。

1.2 壳聚糖衍生物的制备

称取5.0 g低聚壳聚糖加入100.0 mL蒸馏水溶解,搅拌溶解,称取1.0 g马来酸酐(0.5 g邻苯二甲酸酐),用20.0 mL丙酮溶解,然后缓慢加入反应器,在室温下搅拌反应15 h,然后用丙酮沉淀,过滤,产物用丙酮反复洗涤,最后在60℃烘干,得到N-马来(邻苯二甲)酰低聚壳聚糖衍生物[8]。

1.3 结构表征

1.3.1 红外光谱 红外光谱在EQUNOX55傅立叶红外-拉曼光谱仪上进行,采用KBr压片法制样,测定波数范围为500～4 000 cm-1,分辨率为0.8 cm-1。

1.3.2 相对分子质量的测定 凝胶色谱法测定N-酰化低聚壳聚糖相对分子质量大小。测试条件如下:柱子:TOSOH BIOSEP TSK-Gel G4000SWXL (D7.8 mm×300 mm);流动相:0.2 mol/L醋酸钠和醋酸缓冲溶液,p H=4.8;色谱仪:Waters 515型凝胶色谱仪,检测器:Waters 2410示差折光检测器(美国Waters公司);进样量:50μL;柱温:40℃;标准品:葡聚糖。

1.3.3 取代度的测定 准确称量N-酰化低聚壳聚糖0.100 0 g置500 mL烧杯内,准确加入0.103 8 mol/L HCl标准溶液20.00 mL溶解样品,再加入去离子水200 mL稀释、混匀,用0.468 5 mol/L NaOH标准溶液返滴,测定电导率值,得电导率-氢氧化钠体积关系图,添加趋势线,求其回归方程,从而计算N-酰化低聚壳聚糖的取代度[9]。

1.4 对羟基自由基·OH的清除

用p H=7.40的0.05 mol/L KH2PO4-NaOH缓冲溶液分别配制浓度为6.4×10-4mol/L的鲁米诺溶液、0.012 mol/L H2O2和0.8 mg/mL亚铁氰化钾溶液。以缓冲液作为溶剂,配制成系列不同浓度的样品溶液。用流动注射化学发光分析仪依次测定从稀到浓的样品溶液,读出峰面积。清除率= (A0-Ai)/A0×100%。式中A0为空白溶液峰面积,Ai为样品溶液峰面积。经SOD,过氧化氢酶及甘露醇检测,该体系产生的自由基羟基自由基· OH[10]。

1.5 对DPPH自由基的清除

在装有2.0 mL的浓度为1×10-4mol/L DPPH无水乙醇溶液的比色管中,加入不同浓度的样品溶液2.0 mL,摇匀,33℃避光静置30 min,在517 nm处测量吸光度Ai。用去离子水代替样品溶液,得吸光度A0,无水乙醇代替DPPH,得吸光度Aj。清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%[11]。

2 结果与讨论

2.1 红外光谱

图1是低聚壳聚糖及其N-酰化低聚壳聚糖的红外光谱图。NMCOS中1 640 cm-1为烯烃的VC=C振动峰;1 707 cm-1附近出现为不饱和羧基因共轭作用的C=O振动吸收峰;860 cm-1附近为C-H面外振动吸收峰,在壳聚糖未见此峰,这些峰证实了NMCOS中马来酸基的存在[12]。在NPCOS中,1 640 cm-1为烯烃的VC=C振动峰;在750 cm-1附近的吸收峰为邻二取代苯的δAr-H面外弯曲振动峰,这些峰证明了邻苯二甲酸基的存在[13]。NMCOS和NPCOS在1 560 cm-1附近的仲酰胺的δNH振动峰在衍生物中明显增大,同时在1 320 cm-1附近出现VC-N伸缩振动峰,并且在1 073 cm-1和1 023 cm-1处的C3仲羟基和C6伯羟基的C-O的伸缩振动吸收峰与壳聚糖相比没有明显变化,这均证明反应发生在氨基上[7]。凝胶色谱法测得NMCOS和NPCOS的相对分子质量大小分别为5 733和5 029。电导法测定其取代度均为0.25。

2.2 对羟基自由基·OH的清除能力的影响

羟基自由基·OH是一种化学性质很活泼的自由基,它易与生物大分子发生反应,如氨基酸、蛋白质和DNA,对机体危害极大,与衰老、肿瘤等密切相关[15]。

图1 COS、NMCOS和NPCOS的红外光谱Fig.1 FTIR spectra of COS、NMCOS and NPCOS

NMCOS和NPCOS对羟基自由基.OH的清除活性如图2。随着浓度的增加,NMCOS和NPCOS对羟基自由基·OH的清除能力逐渐增强。NPCOS清除羟基自由基·OH的IC50(清除率达到50%时所需自由基清除剂的浓度)为0.06 mmol/ L,而NMCOS没有达到IC50。即取代度相同时, NPCOS对羟基自由基·OH的清除能力更强。

图2 NMCOS和NPCOS对羟基自由基的清除Fig.2 Scavenging effects of NMCOSand NPCOS on hydroxyl radical

低聚壳聚糖及其衍生物中有大量的羟基和氨基,对羟基自由基·OH有如下作用[16]:(1)羟基的氢原子与羟基自由基·OH作用而达到清除目的; (2)氨基和羟基自由基·OH反应生成稳定的大分子自由基;(3)NH2先与溶液中的氢作用形成氨正离子NH3+,再与羟基自由基·OH作用形成稳定物质。对取代度相同的NMCOS和NPCOS,氨基与羟基数目相同。而清除羟基自由基·OH的活性不同,这与取代基团有关。NMCOS和NPCOS均是在低聚壳聚糖氨基上引入取代基,NMCOS的取代基是-COCH=CHCOO-,NPCOS的取代基是-COC6H4COO-,两种基团都是吸电子基团,能降低低聚壳聚糖主链上的电子云密度,使分子内、分子间生成氢键的几率降低,使氨基与羟基的活性增强,易与自由基反应。但是-COC6H4COO-的吸电子效应比-COCH=CHCOO-的吸电子效应强,故取代度相同时,NPCOS对羟基自由基·OH的清除能力比NMCOS强。

2.3 对DPPH的清除能力的影响

图3是NMCOS和NPCOS对DPPH的清除曲线图。NMCOS和NPCOS对DPPH的清除能力均随着浓度的增加而增强。NMCOS和NPCOS的IC50分别是1.2 mmol/L和0.88 mmol/L。NPCOS清除DPPH的能力比NMCOS强。

稳定的DPPH体系是一种广泛用于评价抗氧化剂自由基清除能力的方法。其主要原理是DPPH可以接受自由基清除剂提供的电子或氢从而形成稳定分子。在低聚壳聚糖及其衍生物中,主要是氨基和羟基提供氢与DPPH结合,从而达到清除DPPH的目的。在本体系中,NMCOS和NPCOS取代度相同,氨基和羟基数目相同,但-COC6H4COO-基团的吸电子作用比-COCH=CHCOO-基团的吸电子作用强,从而NPCOS的供氢能力比NMCOS强,故清除DPPH的能力强。

图3 NMCOS和NPCOS对DPPH自由基的清除Fig.3 Scavenging effects of NMCOS and NPCOS on DPPHradical

3 结 语

作者对低聚壳聚糖进行酰化,制得取代度相同的NMCOS和NPCOS。并且考察了其对羟基自由基·OH和DPPH的清除能力。结果表明:取代度相同时,尽管氨基和羟基的数目相同,但是NMCOS和NPCOS对羟基自由基·OH和DPPH的清除效果不同。这说明不同的N-取代基对低聚壳聚糖清除自由基的影响不同。与NMCOS相比,NPCOS引进的-COC6H4COO-的吸电子能力比-COCH=CHCOO-较强,故其清除羟基自由基· OH和DPPH的能力较强。这一结果为低聚壳聚糖及其衍生物的的深入研究有指明了方向。

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(责任编辑:朱明)

The Radical Scavenging Effect of N-Acyl Chitosan Oligosaccharide

SUN Tao, YIN Xu-hong, XIE Jing, LI Li, LAI Ke-qiang, ZHOU Dong-xiang
(College of Food Science,Shanghai Ocean University,Shanhai 201306,China)

N-maleyl chitosan oligosaccharide(NMCOS)and N-phthaloyl chitosan oligosaccharide (NPCOS)with the same substituting degrees(0.25)were synthesized.The structure were characterized byFTIRspectra,themolecularweightwasmeasuredbyGelPermeation Chromatog-raphy(GPC).Their antioxidant activity were evaluated by the scavenging of hydroxyl radical(.OH)and 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical(DPPH).The results showed NPCOS have stronger hydroxyl and DPPH radical scavenging activity than that of NMCOS.The resultspresentedheredemonstratedthattheantioxidantactivityofN-acylChitosan Oligosaccharide with the same substituting degrees was determined by the substituting groups.

chitosan oligosaccharide,N-acyl,antioxidant activity,substituting degree

TS 202.3

:A

1673-1689(2010)03-0406-04

2009-06-15

上海市教育委员会科研项目(07zz134),上海市重点学科建设项目专项基金(T1102),上海市生物医药和农业科技领域重点科技项目(08391911500),2009年上海市优秀学科带头人计划(09XD1402000)。

孙涛(1970-),女,黑龙江依兰人,理学博士,副教授,主要从事多糖的改性及生物功能的开发。Email:taosun@shou.edu.cn