刘合义,余丽芸,侯喜林,孙留霞,周玉龙,王进轶,刘双翼,朴范泽

牛冠状病毒N基因的原核表达及初步应用*

刘合义,余丽芸,侯喜林,孙留霞,周玉龙,王进轶,刘双翼,朴范泽

目的获得牛冠状病毒N基因的全长序列,实现N基因在大肠杆菌中的高效表达,并进行初步应用。方法根据已发表的牛冠状病毒M ebus株的序列设计引物,对BCV-DQ株进行RT-PCR扩增、克隆和测序;将该基因插入到原核表达载体pET-30a(+)上进行原核表达,SDS-PAGE和Western blot检测;用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,建立ELISA检测方法,对部分临床样本进行检测。结果BCV-DQ株N基因全长1 347bp,与GenBank已发表的6株BCV的N基因相比较,核苷酸同源性98.3%以上。构建的重组质粒pET-N能表达出一条大小约为60 ku的蛋白,且能与鼠抗BCV血清发生特异性反应。用建立的ELISA方法对黑龙江不同地区送检的共256份牛血清样品进行检测,结果阳性率65.23%,与病毒中和试验的符合率达95.31%。结论BCV N基因保守性很高,并在原核表达系统中获得了高效表达,其表达产物具有良好的免疫反应原性。临床检测结果表明N蛋白可作为诊断抗原用于牛冠状病毒病的流行病学调查。

牛冠状病毒;N基因;克隆;序列分析;原核表达

牛冠状病毒(Bovine Coronavirus,BCV)是冠状病毒科冠状病毒属成员,为不分节段的单股正链RNA病毒,是引起犊牛腹泻、成年牛冬痢和呼吸道疾病的主要病原〔1〕。冠状病毒属成员分为4个抗原群:第1群包括人冠状病毒HCV-229E、猪传染性胃肠炎病毒、犬冠状病毒等;第2群包括BCV、猪血凝性脑脊髓炎病毒、小鼠肝炎病毒、人冠状病毒HCoV-OC43等;第3群成员有传染性支气管炎病毒等;第 4群为SARS冠状病毒〔2-3〕。……