张丽荣,林毅雄,李红霞,魏泉德,张静涛,方艳梅,周兰兰,郑予柯

珠海市2007-2008年乙型流感病毒基因特性分析*

张丽荣,林毅雄,李红霞,魏泉德,张静涛,方艳梅,周兰兰,郑予柯

目的了解珠海市近两年乙型流感病毒的基因变异情况。方法采集珠海市流感样病例样本进行流感病毒的分离和鉴定,并对分离到的乙型流感病毒进行核酸的提取,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒基因后进行病毒血凝素HA1基因核苷酸序列测定,用Mega、DNA Star、GeneDoc软件对测序结果进行分析处理,并与WHO推荐的疫苗株基因序列进行比对。结果2007-2008年分离的乙型流感毒株分属于Yamagata系和Victoria系两个谱系,谱系内毒株间距离很近。Yamagata系毒株与B/Brisbane/3/2007的核苷酸同源性极高,在99.4%～99.7%之间;Victoria系乙型流感病毒株与B/Malasia/2506/2004的核苷酸同源性亦很高,在98.6%～99.1%之间。与疫苗株和其它流行株相比,本次分离的两个谱系毒株均未发现核苷酸的丢失和插入,但均增加一个潜在的糖基化位点。结论珠海市人群交替流行着Yamagata系和Victoria系两个抗原性不同的进化系的乙型流感病毒,病毒的基因发生了变异。2007-2008两年WHO推荐的乙型流感疫苗株与我地区当年流行株为不同谱系毒株,预防保护效果不好。

乙型流感病毒;血凝素基因;核苷酸序列;Yamagata系;Victoria系

乙型流感病毒是流感的主要病原之一,乙型流感病毒只有一个亚型,自1985年以来,乙型流感病毒根据抗原性和基因特征的不同分为两大谱系Yamagata系和 Victoria系〔1〕,代表株分别为 B/Yamagata/16/88和 B/Victoria/2/87,两个谱系的病毒株在遗传和抗原水平上是不同的〔2〕。近20年来的监测分析表明,乙型流感两大谱系轮换着流行〔3-6〕,人群获得的免疫力迅速失效,因而两大谱系得以持续流行。

流感病毒主要是通过病毒外膜蛋白,特别是血凝素蛋白(hemagglutinin)的重链区HA1的变异来改变抗原特性以逃避机体已有的免疫保护,从而在人群引起反复流行〔7〕。因而通过分析乙型流感病毒HA1区的变异情况,找出变异规律,对于流感流行的预测、疫苗株的筛选具有重要意义。

由于乙型流感病毒主要是在局部地区流行,所以加强各地区的流感监测分析有着重要意义。因此,为了解珠海市乙型流感病毒的变异情况,我们于2007-2008年对流感样病例进行了监测,并对部分分离的乙型流感病毒毒株进行了HA1序列测定及分析。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2007-2008年珠海市流感样病例的咽拭子标本。

1.2 病毒分离培养及鉴定 将流感样病例标本接种狗肾传代细胞(MDCK)培养,有细胞病变(CPE)、血凝实验阳性的培养液送广东省CDC进行型别鉴定。

1.3 病毒RNA提取 使用Qiagen Viral RNA Mini Kit提取病毒株RNA,按说明书操作。

1.4 HA1区全基因核苷酸序列扩增 引物1:5'-CCACAAAATGAAGGCAATAA;引物 2:5'-CCTGTGTAGTAAGGCT TGCTT,引物由上海英骏生物技术有限公司合成。将所选取的样品RNA进行一步法RT-PCR扩增HA1基因全长。反应参数:50℃30min,1个循环;95℃2min,1个循环;95℃30s,55℃30s,72℃1.5min,35个循环;72℃10min,4℃。PCR完成后,用1%琼脂糖凝胶电泳分析结果,扩增片段为985bp。

1.5 序列测定和分析 将PCR扩增产物送上海英骏生物技术有限公司进行测序,测序采用ABI3730型自动测序仪进行。序列结果用Mega、DNA Star、GeneDoc软件进行分析。同时选取2007-2008年北半球乙型流感疫苗株及一些国内代表株的血凝素(HA)基因进行序列和种系进化分析。疫苗株及国内代表株的序列均来自Influenza Sequence Database。

2 结 果

2.1 2007-2008年珠海市乙型流感病毒流行情况

2007年采集流感样病例样本986份,用MDCK细胞分离出流感病毒60株,其中乙型流感病毒11株,占18.3%,从5-9月每月均有乙型流感病毒分离,2007年分离的11株乙型流感病毒全部为Yamagata系。

2008年采集流感样病例样本1 523份,用MDCK细胞分离出流感病毒141株,其中乙型流感病毒30株,占21.3%,除1、2、6月份之外每月均有乙型流感病毒分离。2008年我市人群中乙型流感两个谱系同时存在,但以Victoria系毒株为主。

2.2 2007-2008年珠海市乙型流感病毒HA1区核苷酸和氨基酸序列分析 分别随机挑选各5株2007年和2008年不同月份分离到的乙型流感毒株,对其血凝素基因进行核苷酸序列测定,将其与近年流行株进行比较发现,Yamagata系毒株与B/Brisbane/3/2007的核苷酸同源性极高,在99.4%～99.7%之间,与B/Florida/4/2006的核苷酸同源性较高,在97.3%～97.6%之间(见表1);Victoria系乙型流感病毒株与B/Malasia/2506/2004的核苷酸同源性较高,在 98.6%～99.1%之间,与 B/Shenzhen/155/05的同源性亦较高,在 98.9%～99.3%之间(见表2)。

表1 2007-2008年珠海市Yamagata系乙型流感病毒HA1区核苷酸序列同源性比较Table 1 Analysis on the homology of nucleotide acids of hemagglutinin gene HA1 of Yamagata-like strain of influenza virus B in 2007-2008 in Zhuhai

通过核苷酸进化树可见,2007-2008年10株乙型流感病毒分布在Yamagata系和Victoria系两个分支上,6株 Yamagata系分离株与疫苗株B/Brisbane/3/2007和B/Florida/4/2006距离很近,4株Victoria系分离株与B/Malasia/2506/2004和B/Shenzhen/155/05距离很近(见图1)。

分别将各株核苷酸序列推导出氨基酸序列。有研究表明乙型流感HA1基因的第70-90位和第110-210位上的氨基酸参与乙型流感病毒抗原表位的构成〔8〕,其间氨基酸的变异会导致病毒抗原性改变。本次分离的Yamagata系的6个毒株与B/Florida/4/2006相比较,发生了4处氨基酸替换,分别是第48位精氨酸→赖氨酸,第88位赖氨酸→精氨酸,第108位脯氨酸→丙氨酸,第229位丝氨酸→甘氨酸,与B/Brisbane/3/2007相比较,发生 2处氨基酸替换,即第182位谷氨酰胺→谷氨酸,第196位天冬氨酸→天冬酰胺,而196位的氨基酸替换使毒株在196-198位上的氨基酸形成Asn-Lys-Thr的结果,导致在该处增加了一个潜在的糖基化位点。

图1 2007-2008年珠海市乙型流感病毒HA1区核苷酸基因进化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of HA1 gene of influenza B viruses isolated in Zhuhai in 2007-2008

二处变异位点均位于HA1抗原区表位(见图2)。

表2 2007-2008年珠海市Victoria系乙型流感病毒HA1区核苷酸序列同源性比较Table 2 Analysis on the homology of nucleotide acids of hemagglutinin gene HA1 of Victoria-like strain of influenza virus B in 2007-2008 in Zhuhai

2008年4株Victoria系乙型流感病毒,与B/Malasia/2506/04相比,在 HA1基因的第 70-90位区域未发现氨基酸变异。而在110-210区域,与B/Shenzhen/155/05相同,均在134号位点发生丝氨酸→脯氨酸的替换,与B/Shenzhen/155/05不同的是,有二个分离株190/2008和955/2008在165位出现了天冬酰胺到赖氨酸的替换,并且4株分离株均在199位出现了丙氨酸→苏氨酸的替换,使毒株在197-199位上的氨基酸形成Asn-Glu-Thr的结果,导致在该处增加了一个潜在的糖基化位点(见图3)。

图2 2007-2008年珠海市Yamagata系乙型流感病毒HA1区氨基酸序列分析“-”表示氨基酸序列相同,“—”表示糖基化位点Fig.2 Amino acid analysis of HA1 gene of Yamagata-like strain of influenza B viruses isolated in Zhuhai in 2007-2008

3 讨 论

流感病毒的抗原变异与流感的发生和流行密切相关,流感病毒正是通过不断改变其抗原性来逃避宿主特异性免疫识别和清除,从而不断地引起流行。HA蛋白是流感病毒的主要抗原之一,其抗体能中和流感病毒的感染〔9〕。流感病毒HA基因,主要是HA1编码区在持续不断地、快速地发生突变,乙型流感病毒HA1区氨基酸的替换主要集中于70～90位和110～210位,有研究认为这2个部位与乙型流感病毒的抗原决定簇有关,此区间氨基酸的改变会导致病毒抗原性的改变〔3-4〕。

图3 2007-2008年珠海市Victoria系乙型流感病毒HA1区氨基酸序列分析“-”表示氨基酸序列相同,“—”表示糖基化位点Fig.3 Amino acid analysis of HA1 gene of Victoria-like strain of influenza B viruses isolated in Zhuhai in 2007-2008

监测显示珠海市2007年乙型流感病毒以Yamagata系为优势株。2007-2008年分离的Yamagata系毒株与疫苗株B/Brisbane/3/2007比较,HA1区在110-210位有2个氨基酸位点发生变化,分别为182(Q→E)和 196(D→N),由于196位出现了Asn替换Asp,使毒株在该处形成Asn-Glu-Thr,导致在该处增加了一个潜在的糖基化位点。2008年分离的乙型流感病毒以Victoria系为优势株,分离的4个毒株与WHO推荐的06-07年乙型流感Victoria系疫苗株B/Malasia/2506/04比较,其 HA1区134(S→P)和199(A→T)发生变异,由于在199位点发生 Thr替换Ala,使得在197位点增加了1个糖基化位点。流感病毒血凝素蛋白糖基化的主要作用是稳定血凝素蛋白结构,防止血凝素被水解以及阻碍抗体的识别,所以糖基化位点对血凝素的结构和功能十分重要。乙型流感病毒株HA1区氨基酸位点的替换和糖基化位点的增加,使得其抗原性发生了改变。因此,根据WHO疫苗推荐株生产的疫苗对该年我市乙型流感预防效果并不理想。监测显示,2007-2008年珠海市均有乙型流感病毒流行,且引起小的暴发。

2007-2008年WHO推荐的北半球乙型流感疫苗株属于Yamagata系毒株,2008年监测结果显示本市人群中同时流行着乙型Yamagata系和Victoria系毒株,而以Victoria系为优势毒株,因此本年度的乙型流感疫苗对珠海市的乙型流感不能提供最佳的保护。提示在今后疫苗成分中应考虑我国流感的流行特点,最好包括乙型流感病毒两个谱系毒株的成分。

〔1〕陈继明,郭元吉,吴昆昱,等.乙型流行性感冒病毒两大谱系的起源及其演变特征〔J〕.病毒学报,2001,17(4):322-327.

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〔3〕陈继明,郭元吉,郭俊峰,等.1990-2000年间我国乙型流感病毒HA1基因演变的特征〔J〕.中华实验和临床病毒学杂志,2002,16(3):278-280.

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〔9〕金奇.医学分子病毒学〔M〕.北京:科学出版社,2001:646-647.

Characteristic analysis on HA1 gene of influenza virus B,isolated from 2007 to 2008 in Zhuhai

ZHANG Li-rong,LIN Yi-xiong,LI Hong-xia,WEI Quan-de,ZHANG Jing-tao,FANG Yan-mei,ZHOU Lan-lan,ZHENG Yu-ke
(Zhuhai Centre for Disease Control and Prevention,Zhuhai519000,China)

To understand the variation of hemagglutinin gene HA1 in influenza virus B and evaluate the protective effect of the vaccine strains recommended by WHO,respiratory specimens were collected from the suspected cases in Zhuhai.The influenza viruses were isolated from the specimens and furtherly typed by serological identification.The HA1 genes were sequenced and the data were analyzed by software of Mega,DNA Star and GeneDoc.The results showed that the viruses of Yamagata lineage and Victoria lineage were isolated.The homology of strains in Yamagata lineage and nucleotide acids of B/Brisbane/3/2007 was 99.4%-99.7%.Similarly,the homology of strains in Victoria lineage and nucleotide acids of B/M alasia/2506/2004 was 98.6%-99.1%.Comparing with the vaccine strains and other epidemic strains,there was no deletion or insertion of nucleotide acid in both lineages,but there was a glycosylation site acquired in all the isolated virus strains.It's suggested that the two different lineages of Yamagata and Victoria prevailed alternatively in Zhuhai during 2007 to 2008,and the variation of gene was occurred during these years.As the vaccine strains recommended by WHO were different from the epidemic strains in Zhuhai in lineage,the protective effect was unsatisfied.

influenza virus B;hemagglutinin gene;nucleotide sequence;Yamagata lineage;Victoria lineage

R373.1

A

1002-2694(2010)09-0847-04

*珠海市卫生局资助项目(2007068)

珠海市疾病预防控制中心,珠海 519000;Email:lirongmuzhang@126.com

2009-11-23;

2010-01-16