杨燕萍,郭素霞,陈 晶,林矫矫,刘宗平,程国锋

2.扬州大学兽医学院,扬州 225009

编码日本血吸虫Argonaute蛋白全长cDNA克隆、表达及初步鉴定*

杨燕萍1,2,郭素霞1,陈 晶1,林矫矫1,刘宗平2,程国锋1

目的获得编码日本血吸虫Argonaute基因的全长cDNA,并进行克隆和重组融合蛋白表达。方法 利用RACE技术获得编码日本血吸虫Argonaute基因的全长cDNA并对其进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR(Real time PCR)分析该基因在日本血吸虫中的转录情况。原核表达保守功能域蛋白和全长蛋白,利用保守功能域重组融合蛋白免疫昆明系小鼠制备多克隆抗体。免疫印迹(Western blot)进行免疫学分析。结果 本研究获得了一个编码日本血吸虫Argonaute基因的全长cDNA,其完整开放阅读框为3 030 bp,编码1 009个氨基酸,预测分子量为111.7 kDa。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白序列具有Argonaute家族蛋白的典型结构域特征,且与人、鼠Argonaute蛋白具有较高的同源性。Realtime PCR分析表明该基因在7,14日龄的日本血吸虫童虫中转录较高。Western blot分析制备的多抗具有较高的特异性并能识别全长融合蛋白。结论 获得了编码日本血吸虫Argonaute基因的cDNA及重组蛋白,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

日本血吸虫;Argonaute蛋白;RACE;功能分析

在最近十几年中,研究表明非编码小RNA,诸如小干扰 RNA(small interference RNA,siRNA),微小 RNA(microRNA,miRNA)和 PIWI相关RNA(PIWI interacting RNA,piRNA)等在生物体的生长发育中发挥重要的调控作用〔1〕,Argonaute通过与小分子RNA选择性结合在此调控进程中扮演重要角色。

Argonaute蛋白首先在植物中发现,随后在酵母、线虫、小鼠和人等诸多物种发现此类蛋白分子,它们通常含有 PAZ(PIWI-Argonaute-Zwille)和PIWI两个功能域,因此,将Argonaute蛋白分成PAZ和PIWI两个亚家族。……