杨燕萍,郭素霞,陈 晶,林矫矫,刘宗平,程国锋

2.扬州大学兽医学院,扬州 225009

编码日本血吸虫Argonaute蛋白全长cDNA克隆、表达及初步鉴定*

杨燕萍1,2,郭素霞1,陈 晶1,林矫矫1,刘宗平2,程国锋1

目的获得编码日本血吸虫Argonaute基因的全长cDNA,并进行克隆和重组融合蛋白表达。方法 利用RACE技术获得编码日本血吸虫Argonaute基因的全长cDNA并对其进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR(Real time PCR)分析该基因在日本血吸虫中的转录情况。原核表达保守功能域蛋白和全长蛋白,利用保守功能域重组融合蛋白免疫昆明系小鼠制备多克隆抗体。免疫印迹(Western blot)进行免疫学分析。结果 本研究获得了一个编码日本血吸虫Argonaute基因的全长cDNA,其完整开放阅读框为3 030 bp,编码1 009个氨基酸,预测分子量为111.7 kDa。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白序列具有Argonaute家族蛋白的典型结构域特征,且与人、鼠Argonaute蛋白具有较高的同源性。Realtime PCR分析表明该基因在7,14日龄的日本血吸虫童虫中转录较高。Western blot分析制备的多抗具有较高的特异性并能识别全长融合蛋白。结论 获得了编码日本血吸虫Argonaute基因的cDNA及重组蛋白,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

日本血吸虫;Argonaute蛋白;RACE;功能分析

在最近十几年中,研究表明非编码小RNA,诸如小干扰 RNA(small interference RNA,siRNA),微小 RNA(microRNA,miRNA)和 PIWI相关RNA(PIWI interacting RNA,piRNA)等在生物体的生长发育中发挥重要的调控作用〔1〕,Argonaute通过与小分子RNA选择性结合在此调控进程中扮演重要角色。

Argonaute蛋白首先在植物中发现,随后在酵母、线虫、小鼠和人等诸多物种发现此类蛋白分子,它们通常含有 PAZ(PIWI-Argonaute-Zwille)和PIWI两个功能域,因此,将Argonaute蛋白分成PAZ和PIWI两个亚家族。但在不同物种中含有数目不同的编码基因,如在酵母中含有1个Argonaute蛋白基因,而在线虫中含有27个,在小鼠和人中含有 8 个〔2〕。

目前,在日本血吸虫的研究中尚无有关Argonaute蛋白的研究报道,但利用体外合成的小干扰RNA分子可成功实现血吸虫虫体内基因的敲降〔3〕,血吸虫不同发育时期表达一系列微小RNA分子提示Argonaute蛋白在血吸虫的生长发育中发挥重要的作用〔4-5〕。鉴于此,本研究利用 RACE技术研究日本血吸虫Argonaute蛋白的编码cDNA序列,分析了该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的转录情况,并利用大肠杆菌对Argonaute蛋白进行了重组融合表达,本研究为进一步探讨Argonaute蛋白在血吸虫生长发育中的功能并以此为切入点开发新的抗血吸虫药物靶标和疫苗分子奠定了初步基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和酶 Trizol购自Invitrogen公司;5'-FullRACE Kit,pMD19-T Vector,Prime-ScriptTMRT reagent Kit,SYBR○RPremix Ex TaqTM(Perfect Real Time),限制性内切酶购自大连宝生物工程有限公司;Spin Column DNA Gel Extraction Kit购自生物工程(上海)有限公司;BBST NTA Resin上海博彩生物科技有限公司;RIPA裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司;羊抗小鼠IgG-HRP购自上海鼎国生物技术有限公司;HRPDAB底物显色试剂盒购自天根生化科技有限公司。1.2 菌种和实验动物 大肠杆菌DH5α购自生物工程(上海)有限公司;大肠杆菌BL21购自天根生化科技有限公司;新西兰白兔(雄性,2.5～3.0 kg)购自上海罗泾飞达实验动物养殖场;昆明系小鼠购自上海斯莱克实验动物中心;日本血吸虫中国大陆株尾蚴由中国农业科学院上海兽医研究所钉螺室提供;新西兰白兔分别以腹部贴片法感染5000-20000条血吸虫尾蚴,在感染后第 7、14、22、32和42 d剖杀,以肝门静脉灌注法收集虫体〔6〕,液氮冻存备用。收集42 d感染兔的肝脏并纯化虫卵,液氮冻存备用。

1.3 总RNA的提取和5'RACE的扩增 取液氮中冻存的日本血吸虫虫体,按T rizol试剂盒说明书提取14d童虫总RNA。以人和鼠的Argonaute蛋白氨基酸序列查询GenBank中日本血吸虫数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)获得其中1个日本血吸虫EST片段(GenBank登录号AY809756.1),长 701 bp,不含完整的ORF,但含有3'非编码区。以该 EST序列为模板设计合成5′RACE引物(由Invitrogen公司合成)。5GSP1:5′-GAC TAG GTC GAG AAG TGC CTT GAA TAC CA-3′;5GSP2:5′-ACG CAT GCT TCA CGT ATT GCA CGG AGT TC-3′;5GSP3:5′-CGA GCA GGT GGC TCA AAC TGT ATA AGG TG-3′;5GSP4:5′-CAA CTT GGT CCG CTG GTC CGT TAC CAA TC-3′,具体步骤按5'-Full RACE Kit操作手册进行。将RACE产物克隆到pMD19-T Vector中,挑选阳性克隆,由上海桑尼生物技术有限公司测序。将测序结果与已知序列拼接得到完整序列。

1.4 生物信息学分析 利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)Blast和ORF finder进行同源性分析和编码框的预测;利用DNAStar软件对氨基酸残基数、组成、蛋白质相对分子质量等参数进行分析;根据蛋白质数据库登录的果蝇、小鼠、人及曼氏血吸虫的Ago家族蛋白,包括Dm.Ago1(NP_725342.1),Dm.Ago2(ABB54719.1),Dm.Ago3(ABO26294),Ce.ALG1(NP_510322.2),Ce.ALG2(NP_493837.1),Hs.AGO1(Q9UL18),Hs.AGO2(Q9UKV8),Hs.AGO3(Q9H9G7.2),Hs.AGO4(Q9HCK5),Mm.AGO2(Q8CJG0),Mm.AGO1(Q8CJG1),Mm.AGO3(Q8CJF9),Mm.AGO4(Q8CJF8),Sm.Ago1(Smp_140010),Sm.Ago2(Smp_179320),Ago3(Smp_102690.2),Sm.Ago4(Smp_102690.3),利用ClustalX软件对不同物种的Argonaute蛋白氨基酸序列进行多重比对并进一步利用MEGA4软件构建系统进化树。

1.6 实时荧光定量RT-PCR检测 分别提取日本血吸虫虫卵 、7、14 、22、32 d 及 42 d 虫体总 RNA,定量,用PrimeScriptTMRT reagent Kit反转录获得日本血吸虫cDNA。以日本血吸虫核糖体RNA18s为内参,以不同期别的日本血吸虫cDNA为模板,用SYBR○RGreen I嵌合荧光法进行实时荧光定量PCR分析。Argonaute引物:Sense:5'-TGTGTAATGTGACACGACGA-3', Anti-sense:5'-GCTT TTGCTCTTGACCAAC-3',预期扩增片段长度 165bp。18s引物:Sense:5'-GCAAACTGTT TCATCACCG-3',Anti-sense:5'-CAATCCAACGACCTCACTAA-3',预期扩增片段长度172bp,上述引物均由Invitrogen公司合成。反应体系为 10μ l,包括:5μ L 2×SYBR○RPremix Ex T aqTM,0.2μ L 10μ mol/L 上游引物 ,0.2μ L 10μ mol/L 下游引物,4.1μ L ddH2O,0.5μ L cDNA 模版。反应参数为95℃预变性15s,然后以45个循环进行PCR扩增(95℃5 s,54℃15 s,72℃20 s),每个反应均做3孔重复。

1.7 Argonaute蛋白保守功能域的原核表达及抗体制备 根据生物信息学分析结果,选取PIWI保守功能域设计引物,sense:5'-CTC GAATTCTCTTGGTGCAGATGTTAC-3'(2306-2323bp),antisense:5'-GCGAAGCT TATGCGT TTAAAATTATGC 3-(3102-3119bp)并在上下游引物分别引入HindⅢ、EcoRⅠ酶切位点序列,利用14d cDNA为模板进行PCR扩增,利用Spin Column DNA Gel Extraction Kit回收扩增产物并对PCR产物进行酶切处理,将酶切处理的PCR纯化产物连接到经相同酶切处理的表达载体pET28b(+)上,构建重组质粒pET28b(+)-ago,并转化到大肠杆菌Bl21中培养。挑取阳性克隆分别进行PCR、酶切鉴定和测序验证。将验证为正确的单克隆转至500mL LB培养基中37℃培养,以200r/min摇瓶培养诱导6h。离心收集菌体,超声裂解菌体蛋白,通过Ni柱纯化蛋白,纯化产物用SDS-PAGE电泳检测分析〔7〕。

将纯化后蛋白免疫昆明系小鼠制备多克隆抗体。具体为,应用206佐剂乳化纯化蛋白,免疫剂量为50μ g/只/次,每隔14 d背部皮下多点强化免疫1次,共4次,在第8周收集动物血清,-20℃保存备用。

1.8 Argonaute全长融合蛋白的原核表达、纯化和抗体验证分析 根据全长序列中ORF设计引物Sense:5'-CCGGAAT TCATGCTGAATATGTATGGAACTATT-3'(78-101bp),Anti-sense:5'-CCCGCTCGAGTGAATGGAGGT TGACTGGTG-3'(3185-3204bp),14 d血吸虫cDNA为模板进行PCR扩增,用 Spin Column DNA Gel Extraction Kit回收PCR产物,利用PCR产物两端的EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位点进行双酶切,纯化产物连接到经相同双酶切处理的表达载体pET32a(+)上,构建重组质粒pET32a(+)-ago,并转化到大肠杆菌BL21中培养。挑取单个菌落分别以PCR、酶切鉴定和测序进行验证。取验证为阳性的单克隆转至500mL LB培养基中20℃,200r/min诱导2h。离心所取培养物,收集菌体,超声裂解收集蛋白,通过Ni柱纯化蛋白。应用本研究中制备的多克隆抗体,利用Western blot验证重组融合蛋白。具体为,以RIPA裂解液收集14 d童虫总蛋白,进行SDS-PAGE电泳,然后经 280 mA恒流转膜 2h。用封闭液(PBST配制的5%(m/v)脱脂奶粉)4℃封闭过夜,以PBST洗膜后,依次滴加1∶200的抗血清(37℃孵育2h,洗膜3次,每次10 min)及1∶2 000的H RP标记的羊抗小鼠IgG(37℃孵育 2h,洗膜3次,每次10 min),用HRP-DAB底物显色试剂盒显色后检测目的蛋白。

2 结果与分析

2.1 编码Argonaute蛋白的全长cDNA及生物信息学分析 5'-RACE获得2 510bp产物,生物信息学进一步分析表明日本血吸虫Argonaute全长编码cDNA为3 211 bp,包含3 030 bp的开放阅读框,编码1 009个氨基酸,预测分子量为111.7 kDa。利用Smart软件分析表明此开放阅读框包含PAZ和PIWI功能域。序列多重比较分析表明该基因所编码氨基酸序列与曼氏血吸虫的AGO1具有较高的同源性,达93%,与人AGO1的同源性为 71%,与果蝇AGO1为69%,秀丽线虫为61%。系统进化树分析表明本研究获得的日本血吸虫Argonaute与人和鼠更接近(图1)。

2.2 Argonaute基因的发育时期的转录分析 为了解Argonaute基因在日本血吸虫不同发育时期的表达情况 ,分别提取虫卵 、7d 、14d、22d、32d、42d 虫体的总RNA,以18s作为内参,利用实时荧光定量PCR法检测该基因在上述发育时期的转录情况。结果表明Argonaute在上述几个发育时期均转录,但在7、14d的童虫中转录较高(表1)。

表1 日本血吸虫Argonaute基因期别转录分析Table 1 The transcript profiles of Argonaute in differential development stages of Schistosoma japonicum

图1 日本血吸虫Argonaute蛋白进化树分析Fig.1 Phylogenetic tree of Argonaute proteins

2.3 Argonaute蛋白的保守功能域的原核表达和抗体制备 重组克隆菌经诱导表达,SDS-PAGE分析表明在分子量35kDa处有一条带,与融合蛋白的预期分子量一致(图2)。利用Ni-NTA蛋白纯化树脂获得了较高纯度重组蛋白(图3)。将重组融合蛋白免疫小鼠获得了多克隆抗体。应用此抗体,利用Western blot检测血吸虫全虫蛋白,观察到在约分子量为110kDa左右有明显条带(图4),提示本研究中制备的多克隆抗体具有较高的特异性。

图2 SDS-PAGE分析BL21/pET28b(+)-ago重组蛋白表达Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression products of BL21/pET28b(+)-ago in E.coli

2.3 Argonaute全长蛋白的重组表达、纯化和验证分析 将含有Argonaute全长开放阅读框的重组质粒转移到大肠杆菌BL21中进行诱导表达,SDSPAGE分析表明在分子量约120kDa处有一特异性条带,与Argonaute重组融合蛋白的预期分子量一致(图5)。而且,应用本研究制备的抗体,Western blot分析表明该条带可特异性与抗日本血吸虫PIWI抗体反应(图6)。总之,上述结果说明本研究获得了日本血吸虫Argonaute蛋白全长重组蛋白。

图6 BL21/pET32a(+)-ago重组蛋白的Western Blot分析Fig.6 Western Blot analysis of BL21/pET32a(+)-ago recombinant protein

3 讨 论

血吸虫生活史复杂,有性生殖和无性繁殖交替,中间宿主和终末宿主转换,血吸虫基因的精确表达和精准调控是完成复杂生活史的前提。最近十多年中,研究表明非编码RNA在生命体的生长发育中发挥重要的调控作用,而Argonaute蛋白则是参与此进程的关键分子。

本研究根据小鼠和人的Argonaute蛋白序列查询血吸虫的表达序列标签数据库,利用5'RACE技术扩增其中一个表达序列标签,生物信息学分析表明获得了一个编码日本血吸虫Argonaute蛋白的全长cDNA序列,保守功能域分析表明含有PAZ和PIWI结构域,为Argonaute蛋白典型的结构域特征。曼氏血吸虫的基因组研究表明含有4种Argonaute家族蛋白〔8〕,多重序列比较分析表明本研究中获得日本血吸虫Argonaute蛋白与曼氏血吸虫Argonaute具有较高的同源性。

以18S核糖体RNA为内参,Argonaute蛋白的不同发育时期的转录分析表明此蛋白在7,14 d的日本血吸虫童虫中转录较高,而虫卵与成虫期则较少,推测此蛋白可能通过结合非编码RNA,协同参与血吸虫童虫生长发育的调控。

总之,本研究通过5'RACE技术并结合生物信息学研究获得了一个日本血吸虫编码Argonaute蛋白的全长cDNA,并对其编码蛋白进行了原核表达。利用表达重组融合蛋白,本研究获得了特异性较强的抗体,为深入研究Argonaute蛋白在血吸虫生长发育中的功能奠定了初步基础。

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Cloning,expressing and identifying of a full-length cDNA encoding Argonaute fromSchistosoma japonicum

YANG Yan-ping,GUO Su-xia,CHEN Jing,LIN Jiao-jiao,LIU Zong-ping,CHENG Guo-feng
(Key Laboratory of Animal Parasitology of the Ministry of Agriculture,
Shanghai Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Shanghai200241,China)

The present study was intended to obtain the full-length cDNA encoding Argonaute protein(SjAGO)inSchistosoma japonicumand subsequently express the recombinant protein inE.coliBL21.A cDNA fragment encoding Argonaute was harvested as applying the RNA template isolated from 14 day schistosomula by using 5'RACE technique.Upon bioinformatical extension,a full-length cDNA encoding Argonaute protein fromSchistosoma japonicumwas obtained including a complete Open Reading Frame.The Argonaute protein has 1009 amino acids with 111.7kDa molecular weight predicted.Bioinformatical analysis indicated that theSjAGO contains PAZ and PIWI domain,which is a typical character for Argonaute protein family in other organism such as mice and human.The transcript profile ofSjAGOfrom egg,7,14,22,32 and 42d schistosomes was determined by real-time PCR and showed that the transcript ofSjAGOwas predominantly observed at schistosomula stage.The cDNA fragment encoding PIWI domain was further cloned into a pET28b(+)vector and the recombinant plasmid was transfected intoE.coliBL21cell.The recombinant protein was purified by NTA column.Kunming mice were immunized with the purified protein to raise polyclonal antibodies.The full-length cDNA encodingSjAGOwas also cloned into a pET32a(+)vector to express the recombinant protein.The full-lengthSjAGO expressed inE.coliBL21 was successfully validated when applying the polyclonal antibodies by using Western blot.In conclusion,a full-length cDNA encoding Argonaute protein fromSchistosoma japonicumwas cloned and some preliminary studies were also carried out.Results presented here provide foundational information for further investigation on Argonaute's roles in schistosome development.

Schistosomajaponicum;Argonaute;RACE;clone

R383.2

A

1002-2694(2010)09-0830-05

*国家自然科学基金(30901068),上海市科学技术委员会项目(10410703400),上海市人才发展基金(2009032)和中央级公益性科研院所基本科研业务费项目(2008JB18和2009JB08)

程国锋,Email:chenggfeng@shvri.ac.cn

1.中国农业科学院上海兽医研究所,农业部动物寄生虫学重点开放实验室,上海 200241;

2.扬州大学兽医学院,扬州 225009

2010-03-20;

2010-05-15