刘 峰 ，张 进 ，刘 毅

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.湖南出入境检验检疫局，湖南长沙410004；3.长沙市动物防疫监督站，湖南长沙410013）

猪大肠杆菌病是猪场中由病原性大肠杆菌引起的主要危害仔猪生长发育的一种常见病和多发病。本病在仔猪的临诊表现也有不同，主要有黄痢型、白痢型和水肿型。本病的发病范围不断增广、发病率不断升高、病死率逐渐上升，已逐渐由条件性致病变成一种新的背景性常发病和多发病。猪群中大肠杆菌病的发病率已达到60%以上，其中仔猪黄痢的发病率高达25%以上，仔猪白痢的发病率也将近90%，仔猪水肿病的发病率达15%。仔猪黄痢的死亡率超过56%；仔猪白痢的死亡率超过20%；水肿病的死亡率超过90%。随着抗菌药物的不断应用，细菌中的耐药菌株数量也在不断的增加，目前，耐药性的问题已非常严重，应用常规药物和常规方法防治猪大肠杆菌病的难度越来越大。引起猪大肠杆菌病的大肠杆菌经典的血清型主要是K88、K99和987P三种血清型。但由于大肠杆菌的肠毒素才是大肠杆菌引起人类和动物腹泻的最主要因素，肠毒素质粒和耐药性质粒能经结合配对传递给其他肠道细菌，使这些细菌成为能产肠毒素并具有耐药性的致病菌，也就是说，肠毒素质粒和耐药性质能经结合配对后，便可传递给其他菌毛血清型的大肠杆菌甚至传递给其他非大肠杆菌肠道细菌。可以说，如今的病原性大肠杆菌的血清型越来越复杂，不同地区有不同的血清型甚至不同猪场都有可能有不同血清型。

1 研究新抗生素

近年国内外针对大肠杆菌病的新抗生素研究主要集中在新抗生素的筛选、抗生素产生菌的遗传育种与生物合成、抗生素的分离纯化与产品结构修饰、抗生素产品的分析检测与质量监控、抗生素的药理与临床研究等五个方面。（1）新抗生素（新抗）的筛选包括新抗的来源和筛选的方法两个方面的内容。新抗的来源一是微生物，如运用现代技术可从土壤中的细菌、真菌、放线菌、稀有菌类中寻找，也可从海洋中的真菌、细菌、放线菌、稀有菌类中寻找，前者应在菌类的分离培养方法上多下工夫，后者也需要多摸索分离方法及培养条件；二是从基因中寻找新抗，利用土壤多源基因组技术或海洋微生物基因组技术，把未培养微生物的基因提取出来，经处理后克隆到载体中，再在宿主中进行表达，从而获得结构新颖的先导化合物。新抗的筛选方法还有的采用虚拟筛选方法，即利用计算机技术，采用三维药效模型，以搜寻或分子对接的方法，从化合物库中寻找可能的活性化合物。虚拟筛选后再做生物活性测试，命中率大大提高。（2）抗生素的遗传育种与生物合成。对于抗生素的遗传育种，研究最多的是拮抗自身代谢产物、拮抗前体物质、拮抗结构类似物等，也有采用多因子复合诱变来提高目的产物效价的。但利用基因工程手段进行遗传育种工作，包括基因克隆、基因重组、基因置换、基因中断等技术，进展不大。在生物合成方面，自动控制发酵罐研究有一定进展，自动控制发酵罐各种参数的在线变化是微生物在这种生态系统中，内在生理活动与外在环境相互作用的一种信息，目前，还需反复推敲、理解这些信息的真正意义并将其与要解决的问题联系起来进行调控，才能达到提高效价的目的。（3）抗生素的分离纯化与产品结构修饰。抗生素、微生物药物产品的质量、收率与分离纯化的方法、手段和技术水平密切相关。膜技术是近年发展最快的一种分离纯化手段和技术。一般从发酵液分离纯化抗生素主要有萃取、吸附和结晶三个单元操作，溶液中的生物高分子和悬浮固体杂质影响着这三种分离纯化的收率和产品纯度。对于抗生素产品的结构修饰，我国对β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类等品种的仿制工作已做了多年，但还不能自主创新。（4）抗生素的分析检测和质量监控。国内对注射用抗生素各种盐类的研究较多，已有盐类发现有不足的地方，盐类应有足够的溶解；所制的水溶液pH值应符合注射剂的要求，且较稳定；临床应用全身及局部毒性应较小。（5）抗生素的药理与临床研究。

2 应用中药进行防治

王自然采用中药茜草秧、苦参等13味中药组方对人工感染仔猪大肠杆菌引起的腹泻及自然发病的仔猪进行了治疗试验,结果治愈率达90%以上,有效率达100%。同时探讨了中药组方对仔猪大肠杆菌耐药菌株和非耐药菌株所致腹泻症的治疗效果。马玉芳等选择了几种中草药,配制成名为“白痢散”的制剂，并进行了体外抑菌试验、预防试验和治疗试验。试验结果表明:“白痢散”在平板对分离的致病性大肠杆菌的平均抑菌圈直径为12.5 mm；预防试验中,2处理组分别获得90.0%和81.3%的保护率,效果显著。胡松华等进行了公英泻痢杀对仔猪腹泻的临床治疗试验及体外抑菌试验.临床试验结果表明:公英泻痢杀和痢菌净对哺乳仔猪腹泻的临床治愈率分别为100%和81.25%,经统计分析两者差异显著。由此可见,中药对致病性大肠杆菌具有一定的抑制效果,可作为防治猪大肠杆菌病的一种理想药物；使用中药对猪场也有明显的经济收益，但中药味苦，对猪的采食量有一定的影响，且中药见效慢。

3 应用益生菌进行预防

微生态制剂是指由许多有益微生物及其代谢物构成、可以直接饲喂动物的活菌制剂，它具有无副作用、无残留污染、不产生抗药性等特点，具有抗病、治病、促生长等多种功能。国内外常用的微生态制剂菌种主要有：乳酸酐菌、双歧杆菌、链球菌、芽胞杆菌、放线菌、光合菌、酵母菌等。据刘勇等报道，在35日龄断奶仔猪日粮中添加0.2%～0.4%的微生态活菌制剂，可使粪中大肠杆菌总数明显降低。微生态与饲料添加剂的结合方面，尽管开发了一些有价值的产品，但在产品应用方面存在较大困难，如活菌制剂稳定试较差，易在饲料生产工艺中被破坏；产品种类单一，应用范围有限；效果不稳定等。由于微生态结构极其复杂，试图用一两种微生态制剂来解决十几种抗生素尚未能解决的问题是不可能的。

4 研究耐药质粒消除剂

细菌耐药性是受染色体和（或）质粒上的基因控制。染色体型耐药性是在抗菌药物的存在或不存在的条件下，由某种细菌自发突变产生的，这种情况较少见而且只对某一特定的抗菌素产生耐药性。大多数细菌的耐药性属质粒型耐药性，它由R质粒控制。R质粒能自行复制并具有垂直传播和横向传递的特点，这是造成耐药菌株逐年增多、广泛存在的主要原因。有研究表明R质粒的垂直传播具有一定的稳定性并且R质粒的转化并不见得受质粒的分子量的大小限制。因此，药敏试验对解决耐药性问题只能是权宜之计。有报道耐药质粒可以消除，这对解决耐药性问题有非同寻常的意义，如果找到了一种理想的耐药质粒消除剂和抗菌素制成复方制剂就等于抗菌素的再生。但目前还没有效果令人满意的消除剂，以及在实践中应用的有效方法还须进一步进行研究。

5 研制大肠杆菌疫苗

目前我国应用的猪大肠杆菌疫苗主要有二类：三价全价灭活苗和二价基因工程苗。由于病原性大肠杆菌的血清型越来越多，因此上述疫苗的免疫保护面过窄,固不能达到令人满意的效果。大肠杆菌自家苗是将从本场分离得到的优势致病大肠杆菌菌株利用免疫学原理生产出的灭活佐剂苗，用于预防正在本场发生的猪的大肠杆菌病。用大肠杆菌自家苗预防猪大肠杆菌病有如下优点：针对性强，因为这是用本场发病菌株制备的疫苗，所以制苗菌株的血清型和抗原性和发病菌株的抗血清型和原性高度一致。因而可以克服由标准菌株制备的疫苗所存在的免疫保护面过窄的弱点。安全性好，由于大肠杆菌自家苗为灭活苗。其中的病原微生物已经完全、彻底灭活，所以不存在散毒的危险。对抗菌素有协同作用，其协同作用主要有两方面。一则为接种疫苗后，如仍有少数猪发病，这时用抗菌药物治疗，治疗效果较未接种的发病猪的治疗效果要好；二则为对发病猪可同时接种疫苗和用抗均药物治疗，治疗效果比单独用抗菌药物治疗的治疗效果要好。

6 研制抗体药物

初生仔猪和早期断奶仔猪自身免疫功能的不成熟以及早期断奶应激引起的免疫抑制，是造成仔猪对ETEC敏感性增高、抗病力下降，并引发ETEC感染性腹泻的主要因素。利用外源抗体为仔猪提供被动免疫从而预防和治疗肠道致病性大肠杆菌感染引起的疾病的研究证明了外源性抗体的有效作用。其中，鸡卵黄抗体因其化学性质稳定、特异性抗体含量高、安全性好、易规模化生产等特点，而越来越受到人们的注意。根据抗原的制备方式，预防仔猪大肠杆菌性腹泻卵黄抗体的生产方式可以分为两类：一类是直接用ETEC的菌体免疫原，而另一类则是将经分离纯化后的菌毛蛋白作为免疫原。

王建明等用 ETEC K88、K99、987P、F41标准菌株制成的灭活油佐剂作为免疫原，待产蛋鸡免疫后收集高免卵黄，然后提取、纯化，精制成鸡抗猪大肠杆菌特异性高免卵黄抗体并用于临床。结果表明该制剂安全性好，每头仔猪注射或口服3～5mL剂量，能有效预防仔猪大肠杆菌性腹泻。而徐福洲等作了相样的试验，结果显示治疗仔猪腹泻状况明显减轻，与对照组相比有显著差异；治疗组未出现死亡而对照组仔猪有35%～70%的死亡率。结果表明，卵黄抗体治疗由ETEC所致的仔猪腹泻具有明显的效果。在选择试验菌株时，大部分人选用标准菌株，也有一些研究者选用地方株。高云英等应用仔猪大肠杆菌标准菌株和地方分离菌株混合免疫商品蛋鸡，收获高免蛋制备多价卵黄抗体。经预防、攻毒试验及临床治疗效果观察,对仔猪免疫保护率可达95%以上，攻毒保护率90%以上，临床治愈率80%以上。

7 应用抗体药物

由于仔猪通常通过乳汁感染大肠杆菌，往往来不及对仔猪进行大肠杆菌疫苗免疫接种，即使接种，仔猪也来不及产生足够的免疫应答来抵抗致病性大肠肠杆菌的感染，这是目前仔猪大肠杆菌病流行的重要原因之一。又因为感染仔猪的大肠杆菌耐药性及抗菌药物对仔猪的毒副作用，应用外源抗体对仔猪被动免疫从而预防和治疗仔猪大肠杆菌病具有较强的可行性和可操作性。在众多外源性大肠杆菌抗体中，鸡卵黄抗体因其化学性质稳定、特异性抗体含量高、安全性好、易规模化生产等特点充分凸显其应用价值而备受重视。预防仔猪大肠杆菌性腹泻卵黄抗体的生产方式根据免疫抗原不同可以分为两类：一类是直接用致病性大肠杆菌全菌作为免疫原，另一类则是纯化的致病性大肠杆菌的菌毛蛋白作为免疫原。这两种方式制备的大肠杆菌卵黄抗体对仔猪大肠杆菌病的疗效优良，显示出良好的应用前景。 □

[1]吕志堂，刘志恒.一种从土壤样品中选择性分离假诺卡氏菌的方法［J］.微生物学报,2000,40(4):406～113.

[2]T.Luke Simmons and Kerry L.McPhail etc.Belamide A＝Belamide A,a new antimitotic tetrapeptide from a Panamanian marine cyano-bacterium［J］.Tetrahedron Letters,2006,47（20）:3387～3390.

[3]Martin Tulp,Lars Bohlin.Unconventional natural sources for future drug discovery［J］.Drug Discovery Today,2004,9(10)：450.

[4]郭长彬，徐志斌.基于HPPK靶标酶的分子对接研究-金属离子 Mg2+的影响［J］.化学学报,2005,63（5）:1653

[5]雷肇祖,章健.工业菌种改良述评［J］.工业微生物,2004,34(1):39～50.

[6]Shen B Nonaka K Nonaka K.Enediyne natural product:Biosynthesis and prospect towards engineering novel antitumor agents［J］.Bentham Science Publishers,2005,（2）:357～369.

[7]Wan,Yinhua;Ghosh,Raja,Cui;Zhanfeng and Hale,Geoff.Fractionation of BSA and Monoclonal Antibody Alemtuzumab Using CarrierPhase Ultrafiltration［J］.Biotechnol Bioeng,2005,90(3):303～315.

[8]糜祖煌.氨基糖苷类修饰酶及其基因检测［J］.现代实用医学,2004,16(1):25～31