吴民耀,文瑞丽,师 红,王昭晖,张耀君

(陕西师范大学 a.西北濒危药材资源开发国家工程实验室;b.生命科学学院,西安 710062)

φC31位点特异性整合酶系统研究进展*

吴民耀a,b,文瑞丽b,师 红b,王昭晖b,张耀君b

(陕西师范大学 a.西北濒危药材资源开发国家工程实验室;b.生命科学学院,西安 710062)

介绍了 φC31重组酶作用机制、φC31整合酶在基因治疗及其转基因动物研制中的应用、φC31整合酶催化效率的影响因素,以及 φC31整合酶整合的安全性。实验证实,φC31-int可作用于多种动植物细胞及组织,将目的基因特异地整合到宿主基因组,使目的基因得以持续、高效地表达。近年来该酶在哺乳动物体内和体外的研究进展表明,φC31整合酶已经成为研究转基因、基因治疗及基因修饰的一种重要工具。

φC31整合酶;位点特异性重组;转基因;基因治疗

20世纪 70年代以来,生物工程的飞速发展使得基因重组技术越来越受到研究者的重视。基因重组技术是在实验室条件下人工构建或者修饰DNA,将重组 DNA分子引入受体细胞,并使之增殖和表达。该技术广泛应用于基因治疗及转基因动物研制。基因重组包括同源重组、位点特异性重组、非同源重组以及转座重组。为了将构建的DNA整合进基因组,目前依靠的仍然是非同源重组的随机整合,但整合位点的随机性往往会导致基因的不稳定表达及潜在的突变,重则影响原癌基因或抑癌基因的表达失控。同源重组是非姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组反应严格依赖DNA分子之间的同源性,比较准确,但是重组率较低[1]。

近年来,位点特异性重组酶 (site-specific recombinases,SSRs)引起了科学家的重视,得到了广泛的研究和应用,成为修饰细胞系、转基因以及基因治疗领域的有力工具。

1 位点特异性重组酶

位点特异性重组是发生在 2条链特异位点上的重组,重组的发生需要一段同源序列,即特异性位点(attachment site,att)、位点特异性的催化因子即重组酶(integrases)及其辅助因子(cofactor)参与催化。有些重组酶系统只有位点特异性重组酶和特异位点,而不需要其他辅助因子。重组酶只能催化该特异性位点间的重组,因此重组具有特异性和高度的保守性。

位点特异性重组酶家族根据序列的同源性及催化机制分为 2个家族：酪氨酸家族和丝氨酸家族。酪氨酸家族有λ重组酶、P1噬菌体的 Cre重组酶、酵母的 FLP转位酶(invertase)及细菌的XerC蛋白等;丝氨酸家族有 φC31,Tn3,R4,TP901-1等。迄今发现的重组酶虽然已有几百种,但得到广泛应用的只有酪氨酸家族的 In,t Cre,FLP和丝氨酸家族的 φC31。

2 φC31重组酶作用机制

丝氨酸重组酶家族中的链霉菌噬菌体 φC31整合酶由链霉菌噬菌体编码,能识别噬菌体上 attP位点(phage attach m ent site)和宿主基因组 attB位点(bacterial attach m ent site)的介导特异性重组反应,从而将噬菌体 DNA整合到宿主的基因组中[2-3]。研究表明,φC31噬菌体上的 attP位点和宿主链霉菌基因组上 attB位点具有一定的同源性,而 attP和 attB最小活性序列长度分别为 39bp和 34bp。φC31整合酶分别从 39bp的 attP和 34bp的 attB序列的中心位置 TTG后的碱基开始切割双链 DNA,旋转 180°后再连接起来,形成 36bp的 a-t tL和 37bp的 attR。在没有其他辅因子时,attR和attL不再是整合酶的底物,单向插入了基因序列[4]。目前应用较为广泛的 Cre及 FLP重组酶介导的重组具有双向性,从而导致可逆的位点特异性重组反应,使得重组效率降低,所以 φC31整合酶是基因整合一个高效工具。

研究人员在果蝇、爪蟾、小鼠、大鼠、兔、牛、人、拟南芥、烟草、小麦等动植物基因组多种生物基因组中发现一些与 φC31噬菌体有着同源性的基因序列,并证实 φC31整合酶可识别此类序列,而且能介导与 attB位点的特异性重组。进一步的研究从小鼠整合事件中鉴定出 57个假 attP位点。人类基因组大约有 370个假 attP位点。在人基因组假 attP位点分布的基因背景研究中,发现人基因组序列中假 attP位点 74.5%位于基因间, 24.4%位于基因内含子,仅有1.1%位于外显子中[5],该假 attP位点分布比例在实验中得到了验证。研究人员分别用带有 attB及 attP的质粒载体转染 293细胞,发现带有 attB载体整合效率提高了 5～10倍。由于假 attP位点大多在基因组编码序列之外,周围无功能基因,因此外源基因在这些位点整合一般不影响宿主基因组及外源基因自身的表达[6],因此人们将带有 attB序列载体于携带φC31整合酶整合酶基因的载体共转染,使之在φC31整合酶作用下与假 attP特异性重组,从而将目的基因整合到哺乳动物基因组中。

3 φC31整合酶在转基因动物研制及基因治疗中的应用

大量的研究表明,φC31整合酶可作用于多种细胞环境,包括果蝇、非洲爪蟾、斑马鱼以及哺乳动物细胞等。目前,φC31整合酶已成为转基因、基因治疗、基因靶向敲除及细胞系处理一个有效的工具,具有广阔的应用前景。

3.1 φC31整合酶转基因动物研制中的应用

尽管人们对 φC31整合酶系统的关注主要集中在基因治疗方面,但是 φC31整合酶系统对转基因方面的工作也起到发展的作用。

转基因研制方面目前应用最为广泛的是原核显微注射法,该方法可以使外源基因在染色体上随机整合,外源基因整合率和表达率较低,往往影响了后期基因表达与调控研究。而 φC31整合酶系统与显微注射技术结合大大提高了整合效率,并且可以将目的基因定点整合至所期待的染色体位置。

φC31整合酶被证明可作用于昆虫基因组。研究者用果蝇 P因子在果蝇胚胎的基因组上随插入一些 attP位点,然后用 φC31整合酶的编码mRNA和带有 attB的质粒进行共同显微注射,结果发现 46%的果蝇发生了转基因,而且整个转基因耗时较短,可用于其他转基因的制作[7-8]。在蚊子当中,φC31整合酶也可介导高效和准确的转基因[9],另外,该酶也被证明可以在桑蚕的细胞中发生作用[10]。最近,φC31整合酶正被选择用于昆虫基因组的快速和精确的操作。

φC31整合酶系统也被应用于创建转基因爪蟾[11-12]效率可以高达 40%,使得该系统成为一种简单而有效的爪蟾转基因方法。近年来,研究者发现 φC31整合酶可作用于斑马鱼细胞,且 φC31整合酶介导的整合效率高于 Cre/lox位点特异性重组系统[13]。

研究者通过共注射 φC31整合酶的编码mRNA和带有 attB的质粒 DNA到小鼠的胚胎中,检测到该质粒在假 attP位点上整合,且发现 2.6%的转基因后代[14]。Belteki等[15]也通过制备携带φC31位点特异性整合酶系统的胚胎干细胞(ES cell)成功实现了转基因小鼠的制备。φC31整合酶表达载体 pCMV-int和含有 attB序列的绿色荧光蛋白表达载体 pEGFP-N1-attB共同注射出生牛的成纤维细胞,所有的细胞克隆均表达绿色荧光蛋白,而且研究人员发现了 4个 φC31整合酶所介导的整合热点“H ot Spots”,证明该酶可以运用于转基因牛的研究当中[16]。φC31整合酶被证明可作用于人的胚胎干细胞,携带EGFP基因的 2种载体均成功整合到假的 attP位点,并且在传代后的细胞中稳定表达,没有明显的毒副作用,且能维持人的胚胎干细胞的多能性[17]。

在转基因植物的研究中,φC31整合酶基因在模式生物拟南芥OXS3启动子的调控下删除二倍体拟南芥基因组 attP侧翼的靶向序列,并且证实这种删除是保守的,从而说明 φC31整合酶是植物基因工程学一种有效的工具,可介导靶向基因的切除及转基因[18]。此外,φC31整合酶被证明可作用于多种小麦品种基因组,并可稳定地遗传给子代[19]。在转基因烟草的研制中,φC31整合酶介导基因的重组和靶基因的删除[20-21]。

除了用于转基因实验以及染色体的操作, φC31整合酶也被证实可以用于创建重组蛋白高水平表达的细胞系。在 CHO细胞系中,φC31整合酶所介导的整合相对于随机整合具有更高水平的蛋白质表达[22]。φC31整合酶是介导细胞内抗体-胞内核糖体插入位点-复合蛋白整合及表达的一种有力的工具[23]。可见 φC31整合酶可用于乳腺反应器的研究,产生高水平表达蛋白质。

3.2 φC31整合酶在基因治疗中的应用

φC31整合酶被发现可通过识别哺乳动物基因组上假 attP位点作用于哺乳动物细胞中以后, OlivaresE.C等人用高压尾静脉注射的方法将含有 attB位点的人凝血因子 IX(hu m an blood clotting factor I X,hFIX)表达载体和φC31整合酶表达质粒一同注射到小鼠尾静脉。结果表明,φC31整合酶可介导 hFI X表达载体通过肝脏基因组内生 attP位点整合到小鼠肝脏细胞。φC31整合酶存在的情况下, IX因子得以长期稳定的表达。该研究也表明了 φC31整合酶在活体内的整合异性可能会比在培养细胞中的高,而且表达更持久,甚至有些小鼠终身的表达都不发生改变[24]。

H eldP.K[25]等用带有 FAH的 cDNA以 attB位点的质粒和 φC31整合酶的表达质粒共同高压注射FAH缺陷型的小鼠尾静脉以研究基因治疗治疗遗传性酪氨酸血症。该实验结果表明整合酶介导的基因表达可长期表达,甚至是在多次细胞分裂之后。

交界型大疱性表皮松解症(junctional epidermolysis bullosa,JEB)是一组皮肤基底膜带透明板处发生水疱和大疱的隐性遗传疾病。用带有 attB位点和筛选标记的层粘连蛋白-5(lam inin 5)表达载体与 φC31整合酶共转染来源于 JEB病人的JEB角质细胞(JEB keratinocytes),筛选出稳定表达细胞,并移植到免疫缺陷型小鼠体内。用免疫组织化学法分析植入的细胞,发现它们并不能和正常的细胞所区别。被移植的皮肤细胞的完整性大约维持了 14周[26]。

Chalberg等[27]的研究表明,φC31整合酶具有治疗视网膜遗传疾病的潜能。含有 eGFP基因的质粒 DNA注射入大鼠 retinal pigment epithelium (RPE)细胞当中,并通过电击使 DNA进入细胞当中。与 φC31整合酶共同注射的处理组在注射后48 h的 eGFP基因表达最强,在 4.5个月后仍能检测到其表达,而且表达量是未加 φC31整合酶处理组的 85倍,表现出相当强的基因整合及表达。

在关节疾病基因治疗的研究中,φC31整合酶在人类滑膜细胞和兔膝关节滑膜中的作用使得标记基因的表达明显提高,所以 φC31整合酶可能是基因治疗关节疾病的一种的方法[28]。

在肌肉疾病的研究中,将含有 attB位点的荧光素酶的表达载体和 φC31整合酶表达载体用活体肌肉注射入小鼠后肢胫骨前部肌肉中,接着用微电极插入注射部位附近电击穿孔,使得质粒DNA进入细胞中。用生物体发光成像系统分析得出,在 φC31整合酶的作用下荧光素酶的表达提高了 5～10倍。而含有 attB位点得抗肌萎缩蛋白(dystrophin)表达质粒载体用上述方法转至小鼠肌肉细胞中,抗肌萎缩蛋白的靶向整合和高水平表达使得肌纤维得到了更好的保护,减缓了肌肉萎缩[29]。

在人的血管疾病研究方面,用以上方法使得含有 attB位点的 VEGF的表达载体和 φC31整合酶表达载体DNA进入细胞当中,PCR结果证实位点特异性VEGF表达载体整合至肌肉组织细胞中常见的 φC31整合酶整合位点。结果表明,φC31整合酶整合系统可被用于治疗外周血管类疾病[30]。

研究者将携带有荧光素酶基因和 attB位点的质粒载体和可在小鼠神经祖细胞 mouse neural progenitor cells(mNPCs)中表达 φC31整合酶得质粒载体共转染细胞核,检测到荧光素酶可在mNPCs中长期且稳定表达,并且随着细胞的增值和分化在神经元细胞和神经胶质细胞中表达,被认为可用于神经退行性疾病的基因治疗[31]。

在小鼠肺泡 II型(MLE12)细胞中利用聚乙烯亚胺(Polyethylen im ine,PEI)-DNA复合物与编码 φC31整合酶的载体共同注射到小鼠尾静脉中。PEI-DNA复合物是将基因转入肺的一种有效的方法。研究表明除了内皮细胞外,肺泡 I型、II型细胞都可成功地转染[32]。

4 φC31整合酶催化效率的影响因素

φC31整合酶的作用效率主要取决于酶的特异性构象、底物的特性。

在多种生物种存在的与 attB序列具有同源性的 pseudo-attP位点的特性确保了定点整合的精确性。φC31整合酶识别假 attP位点,介导目的基因整合从而获得长期、稳定的表达。一般认为,pseudo attP位点一般存在于哺乳动物染色体表达旺盛的区域,这些区域具有开放的染色体构象,易于被φC31整合酶识别[6]。

转染入细胞但并未整合的瞬间表达质粒载体表达的衰减是由于质粒中高水平的甲基化CpG和原核骨架序列导致质粒基因沉默。启动子影响着转基因表达的长久性,不同的组织有不同的整合效率是由于φC31整合酶对于不同组织基因的“可近性”。研究者用含有 EGFP和荧光素酶复合物基因的质粒载体与 φC31整合酶瞬间表达载体共注射于小鼠尾静脉。用半巢式 PCR检测上述质粒在肺泡细胞中的整合反应表明在有荧光反应的 15个整合产物中只有 7个整合于人们所描述的整合热点(H ot spot)mpsL1位点上,其余可能整合于其他整合位点,从而得出不同类型的细胞整合位点有所不同。研究者继而用 phiC31整合酶mRNA转染各种类型细胞发现 φC31整合酶介导的重组产物表达水平各不相同,并发现一个可能抑制φC31整合酶整合酶表达的抑制因子 DAXX,但是至于其他未知的的抑制因子还有待进一步的探索[33]。

携带有核定位信号(nuclear localization signa,l NLS)的 φC31整合酶基因被证明在可进入细胞核中介导整合反应,尤其是在不分裂的细胞中,如肺泡 I型 II型细胞,并且可以提高整合效率[34]。

实验证实,载体骨架序列可影响 φC31整合酶介导的整合效率。用介导 FAH基因整合到人基因组的研究表明,φC31整合酶可介导成功的整合,但是整合效率仅仅有 4%左右,从而推断酶的性能可能需要提高。因此,要确定质粒的骨架序列对 φC31整合酶整合作用影响的确切作用机理,还需要进一步的实验证实[35]。为了提高 φC31整合酶的效率,研究人员突变处理了 φC31整合酶,并研究其作用于人类基因组内生 attP位点和提前插入的 attP位点上的整合效率。研究结果表明,突变 φC31整合酶 P2具有野生型 φC31整合酶 2倍的染色体整合效率,而 P3介导的整合反应可在小鼠肝脏中长时间表达 hFI X,且表达时间是野生型 φC31整合酶介导反应的 2倍。φC31整合酶的此类突变对基因改造和基因治疗是有用的,而且表明改造 φC31整合酶以使之具有更好的性能是可行的[36]。

5 φC31整合酶整合的安全性

研究表明,基因组的改变可能影响正常基因的表达或者激活原癌基因和抑癌基因,从而导致癌症的发生。任何整合系统来说都存在着插入突变的风险。由于在染色体上具有 φC31整合酶所识别的特异性序列 attB,从而减少了随机整合的程度。φC31整合酶的应用大大改善了此类缺点。细胞水平研究表明,φC31整合酶介导的基因重组大部分还未发现插入任何位点靠近癌基因,只有10%的整合位点在培养的细胞中发现染色体异常,这些异常事件也大多发生在大量存在于基因间非编码序列及基因内含子上的假 attP位点。哺乳动物整合事件中,所鉴定到的整合热点都不和癌基因接近,因此 φC31整合酶系统相对于随机整合系统发生癌症的风险非常小[6-5]。在哺乳动物动物体内整合研究中,φC31整合酶介导的整合反应还未发现与肿瘤或其它不利的结果。

在转基因动物应用当中,φC31整合酶系统也未发现致病性,大量编码 φC31整合酶的 mRNA被注射入爪蟾和果蝇的早期胚胎,结果并未导致子代存活率的下降或者提高子代的异常率。另外,用 φC31整合酶处理的小鼠胚胎干细胞而产生的小鼠可以正常得发育和繁殖,这些结果表明φC31整合酶在转基因动物表达不具有很高的毒性。φC31整合酶在目前接受处理的组织当中还没有发现免疫原性的获得。目前在运用 φC31整合酶进行基因改造的实验中,φC31整合酶基因都是位于瞬间表达载体上,并不整合于基因组上稳定表达,所以细胞毒性相对较小。更多检验 φC31整合酶免疫原性的工作正在进行当中[37]。

6 展望

φC31整合酶系统与病毒载体系统相比具有位点特异性、高效性、表达的长期性而且作用于染色体时无需其他辅助因子。基于 φC31整合酶系统的以上特性,φC31整合酶的应用涉及到基因修饰、转基因、基因治疗等方向的研究。与其他常用的整合酶相比,φC31整合酶介导的重组反应具有不可逆性,从而确保目的基因整合至基因组后不会再被删除。φC31整合酶系统已经较多的应用于各种疾病的基因治疗发面,而在转基因动物方面的研究相对较少。该系统在产生转基因动物尤其是动物乳腺反应器方面有较为广阔的前景。φC31整合酶系统与显微注射技术的配合将大大提高转基因的效率和降低非特异性整合所带来的染色体有害变异。随着 φC31整合酶研究的深入,需要探索怎样提高不同细胞和组织中 φC31整合酶作用效率。

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(责任编辑 刘 舸)

Research of φC31 Site-specific Integrase Syste m

WU M ing-yaoa,b,WEN Ru-i lib,SH IHongb,WANG Zhao-huib,ZHANG Yao-junb

(a.NationalEngineering Laboratory ofEndangeredmedicinal resources development in Northwest; b.College ofL ife Sciences,ShanxiNro malUniversity,X i'an 710062,China)

The actionm echani sm of φC31 integrase,its application in gene therapy and the research of transgenic an ima,l the affecting factors of its catalyzing efficiency and its safety are introduced in this paper.Exper imental events illum inated thatφC31 integrase brought out efficiency and stable expression of target gene ingration on genom ic of cells and tissue ofmanifold an im al and several plants. In recent years,research onφC31 integrase in vitro and in vivi ofmamm alians indicated thatφC31 integrase is a significant tool for transgenic research、gene therapy、gene modification.

φC31 integrase;site-specific recombinations;transgenic;gene therapy

book=7,ebook=1

Q81

A

1674-8425(2010)07-0030-07

2010-03-25

吴民耀(1963—),男,陕西兴平人,德国慕尼黑大学博士,陕西师范大学生命科学学院副教授,主要从事干细胞生物学、胚胎生物工程、基因工程方面的研究。