徐晓峰 刘小平 陈静家 李 阳 钱 栋 张志坚 刘进炼

1(江苏大学附属医院骨科，镇江 212001)

2(江苏大学临床医学院，镇江 212013)

3(上海交大医学院苏州九龙医院骨科，苏州 215021)

引言

目前，组织工程骨的研究主要集中在支架材料、种子细胞和生长因子的构建方式上面。其中，良好的支架材料和生长因子对细胞的粘附，增殖、分化具有决定性作用。然而生长因子存在稳定性差、半衰期短等不足，限制了其临床应用，利用载体或缓释系统负载生长因子，既能保护生长因子的生物活性，又可以使生长因子缓慢释放，从而持续促进细胞生长及组织修复再生，因而控制释放载体材料的应用是目前研究的方向之一。采用聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及其共聚物(PLGA)等合成生物材料制备的多孔支架，由于其制作过程复杂，大都要用到有机溶剂并需要水溶液后处理，从保持生长因子活性和载药量考虑，很难将生长因子直接加入到聚合物原料中共处理。还有将生长因子包埋于疏水性可降解聚合物的微粒中，在多孔支架的制备过程中加入到基质材料中，但这种方法有操作复杂、载药量低、生长因子释放速率不易调控等问题[1]，而利用生物学方法对已成型的多孔支架进行表面处理后将生长因子负载上去，不但方法简单，且可以保持生长因子的活性，是目前一种制备缓释系统较好的方法。本研究利用生物学方法，将血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)负载于纳米晶胶原基骨(nanoHydroxyapatite/collagen，nHAC)上，制备具有VEGF缓释效果的复合支架，探讨这种复合材料对成骨诱导的人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)黏附及增殖的影响，旨在通过体外实验为骨组织工程寻找较理想的复合支架材料，为骨缺损的治疗提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 主要材料、试剂及仪器

纳米晶胶原基骨(nHAC)、5mm×5mm×5mm规格，由北京益而康生物工程开发中心提供;大鼠VEGF(Peprotech公司)、牛源纤维连接蛋白(fibronectin，FN)(Sigma公司)、大鼠 VEGFElisa 试剂盒(R＆D公司)、LDMEM培养基(Gibco公司)、类标准胎牛血清(上海生物工程有限公司)、1.0779/mL Ficon淋巴细胞分离液(天津颧洋生物公司)、胰蛋白酶(Sigma公司)、肝素(heparin，HP)、地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠。离心机、超净工作台、电子分析天平、酶标仪、CO2细胞培养箱、倒置相差显微镜、电镜扫描仪。

1.2 方法

1.2.1 复合支架材料的制备

1.2.1.1 nHAC的预处理

将5mm×5mm×5mm大小的nHAC骨块用无水酒精浸泡24 h，取出后三蒸水反复冲洗10遍，再用其浸泡48 h。

1.2.1.2 A组nHAC-FN-HP-VEGF的制备

将预处理好的nHAC骨块浸泡于FN溶液中(0.25 mg/mL)，振荡混匀器搅拌 15 min，4 ℃ 浸泡48 h;取出后置于肝素溶液中，振荡混匀器搅拌15 min，4℃浸泡48 h;再取出后置于 VEGF溶液中(0.1 mg/mL)，振荡混匀器搅拌 15 min，4 ℃浸泡2 h。

1.2.1.3 B组nHAC-FN-VEGF的制备

将预处理过的nHAC骨块浸泡于FN溶液中(0.25 mg/mL)，振荡混匀器搅拌 15 min，4 ℃ 浸泡48 h;取出后置于VEGF溶液中(0.1 mg/mL)，振荡混匀器搅拌15 min，4℃浸泡2 h。

1.2.1.4 C组nHAC-HP-VEGF的制备

将预处理过的nHAC骨块浸泡于肝素溶液中，振荡混匀器搅拌15 min，4℃浸泡48 h;取出后置于VEGF溶液中(0.1 mg/mL)，振荡混匀器搅拌15 min，4 ℃浸泡2 h。

1.2.1.5 D组nHAC-VEGF的制备

将预处理过的nHAC骨块浸泡于VEGF溶液中(0.1 mg/mL)，振荡混匀器搅拌15 min，4 ℃浸泡2 h。

1.2.2 各复合支架浸泡液取样

将制备好的上述四组复合支架每组取样本4个，分别置于无菌试管中，加1%BSA-PBS(pH 7.2)缓冲液500 μL浸泡，每过24 h吸出全部浸泡液移至无菌试管，再向样本试管内添加等量1%BSA-PBS(pH=7.2)缓冲液，取出的浸泡液置于-70℃冰箱保存，待行Elisa检测。

1.2.3 hMSCs的分离、培养及成骨诱导

骨髓标本取自4名健康男性青年自愿者(23、26、29、30岁)，4人均无全身性疾病和代谢性疾病，取得知情同意后，无菌条件下于髂后上棘处抽取骨髓共6 mL，置于抗凝环境。密度梯度离心法分离有核细胞层，得均一性较好的hMSCs，将其反复吹打混匀后置于含10%胎牛血清的LDMEM培养基内，在37℃、5%CO2的孵箱中培养、扩增、传代，取第三代hMSCs置于含10%胎牛血清、10 nmol/L地塞米松、50 mg/L维生素 C，10 mmol/L β-甘油磷酸钠的 LDMEM培养基中行成骨细胞诱导培养14 d。

1.2.4 构建组织工程骨

将上述4组支架每组取12个样本置于24孔培养板内，0.25%胰酶消化成骨诱导的MSCs，制成3×106/mL的细胞悬液，吸取100 μL，分别滴加到已置入24孔板的四种复合材料表面，37℃，5%CO2，在饱和湿度静置3 h后反转材料，向每组材料的另一面滴加100 μL 细胞悬液，37 ℃，5%CO2，饱和湿度静置培养3 h后，加上述成骨诱导培养液浸没材料，置于孵箱中培养，在不同时相点分别取材进行各项指标的观测。

1.3 观测指标

1.3.1 VEGF体外释放检测

VEGF体外释放实验可采取双抗夹心法ELISA测定。取每天收集的样本浸泡液100 μL，等量稀释后用大鼠VEGF ELISA试剂盒检测，用酶标仪于280 nm处测出液体中VEGF吸收光度，以吸光度间接反应VEGF浓度，绘制出各样本释放曲线。

1.3.2 hMSCs成骨诱导的鉴定

hMSCs经诱导培养14 d后，行碱性磷酸酶(ALP)细胞化学染色、I型胶原免疫荧光染色。

1.3.3 支架的细胞黏附率测定

接种后6 h，分别取每组材料4个样本，0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗涤4次，使黏附在材料上的细胞脱落，细胞计数板进行计数，根据公式：细胞黏附率=(黏附细胞数/接种细胞数)×100%，计算细胞黏附率。

1.3.4 增殖细胞计数

支架上的细胞培养到第3、7、10、14 d时，每组材料各取样本4块，PBS洗涤4遍，0.25%胰酶消化细胞，反复吹打支架后加入等量含10%FBS的培养基终止消化，取出支架，培养液离心，制悬，计数。

1.3.5 碱性磷酸酶(ALP)活性检测

上述计数后的细胞悬液，在冰浴中用超声细胞破碎机处理5次，6 s/次，共30 s。然后，1000 r/min离心5 min，取上清液，按碱性磷酸酶试剂盒介绍的方法，算出碱性磷酸酶比活性。

1.3.6 扫描电镜观察

细胞与材料联合培养7 d和14 d时，每组分别取出4块细胞支架复合物，4%多聚甲醛-2.5%的戊二醛固定，乙醇梯度脱水，临界点干燥，喷金，扫描电镜下观察细胞生长情况。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组支架VEGF释放量和持续时间的比较

A组中FN通过氢键以及范德华力等与nHAC表面非特异性结合，分布于nHAC的网状空隙内，后经FN分子结构中C端和N端的肝素结合位点与肝素形成较稳定的共价键，将其结合于纤维连接蛋白之上，再利用肝素对VEGF的特殊亲和性，将VEGF负载于nHAC支架之上，nHAC-FN-HP-VEGF由分子间共价健和范德华力相互作用后，形成较稳定的复合物，使VEGF早期的突释量小于对照组B，后期随着FN的水解以及分子间共价键和范德华力的减弱，VEGF稳定持续的释放，时间长达14 d，且各时间点的VEGF释放量明显高于其他组(P＜0.05)。B组中缺少肝素对VEGF的共价结合，VEGF与FN只是分子间范德华力作用，负载量少，稳定性差，释放较快 (时间约6 d)。C、D组中缺少FN对nHAC表面修饰作用，较少的HP-VEGF复合物或VEGF贴附于nHAC表面，较容易脱落入浸泡液中(第1 d大部分突释入浸泡液，第2 d几乎全部释放，见图1)。

2.2 hMSCs成骨诱导的鉴定

图1 四组支架VEGF释放曲线Fig.1 The releasing arcuation of VEGF in four experiment groups

hMSCs经诱导培养2周后，倒置显微镜下见大部分细胞体积增大，突起增多，呈多边形;碱性磷酸酶细胞化学染色及免疫荧光染色阳性。

2.3 材料的细胞黏附率测定

接种6 h后，4组材料的细胞黏附率分别为：A组 61.8% ±2.1%、B 组 61.2% ±3.0%%、C 组40.2% ±2.5%、D 组 39.8% ±3.8%。A、B 两组之间无显著性差异(P ＞0.05)，C、D两组之间无显著性差异(P ＞0.05)，A、B组分别与C、D组之间有显著性差异(P＜0.05)。

2.4 支架材料上的细胞计数

如图2所示，在4组材料中，细胞随培养时间延长而逐渐增多，且相同时相点A组材料上的细胞数量最多，D组最少。其中，A组与B、C、D组之间比较，P ＜0.05，有显著性差异。

2.5 碱性磷酸酶(ALP)表达量检测

如表1所示，相同时相点A组ALP表达量最高，与其余各组比较有显著性差异(P＜0.05)

表1 4组支架材料不同时间点ALP表达量检测(())(U/100 mL)Tab.1 The expression of ALP in four groups at different time points(())(U/100 mL)

*相同时间点与A组比较差异有显著性(P＜0.05)

培养时间/d组别10 14 A 组 12.69 ±0.25 18.93 ±0.21 32.52 ±0.48 22.45 ±0.2837 B 组 10.05 ±0.18* 15.82 ±0.26* 25.24 ±0.38* 15.25 ±0.32*C 组 5.76 ±0.20* 8.25 ±0.18* 14.92 ±0.35* 11.21 ±0.25*D 组 5.66 ±0.21* 8.26 ±0.22*13.89 ±0.32* 10.22 ±0.23*

图2 不同时间点各组支架材料上细胞数量Fig.2 Cell counts of MSCs attached to different scaffolds at different time pointss

图3 扫面电镜观察(1000×)(①：胞体;②：细胞突起连接;③：支架空隙)。(a)和(b)A组7和14 d;(c)和(d)B组7和14 d;(e)和(f)C组7和14 d;(g)和(h)D组7和14 dFig.3 Scanning electron microscopy pictures(1000 ×)(①：cell body;②：cell process linkage;③vacant space of scaffold).(a)and(b)group A for 7 and 14 days;(c)and(d)group B for 7 and 14 days;(e)and(f)group C for 7 and 14 days;(g)and(h)group D for 7 and 14 days

2.6 扫描电镜观察

培养7 d后，电镜下见A组的细胞在(nHACFN-HP-VEGF)支架表面和孔隙内生长良好，细胞突起接触融合，细胞密集区域可见细胞外基质形成，大量细胞形成片状，包绕在材料表面(见图3(a))，14 d后见细胞大量增殖，细胞体积增大，大量细胞形成片状包绕材料表面和支架空隙(见图3(b).在其余三组7 d后，电镜可见黏附的细胞数量较少，表面细胞突起融合欠佳，表现伸展不足;(见图3(c)、(e)和(g)).14 d电镜示细胞细胞数量及突起连接略增加，连接欠紧密(见图3中(d)、(f)和(h))。

3 讨论

全世界每年有数以百万计的骨组织损伤患者需要接受手术治疗[2]，功能性修复与重建一直是现代医学力求解决的难题[3]。利用组织工程技术构建组织工程骨治疗骨缺损是具有较好临床应用价值的治疗策略，其中支架材料是构建组织工程骨的关键要素之一。寻找一种适合种子细胞发挥最优生物功能的、带有生长因子缓释系统的复合支架材料，是骨组织工程研究的热点。

纳米晶胶原基骨(nHAC)晶体与胶原分子接近天然骨中矿物和胶原的组装结构，具有与天然松质骨类似的三维孔洞网络结构，孔隙大小约100 μm[4]，已经作为骨缺损代用人工合成生物支架材料应用于临床[5]，它能与骨髓间充质干细胞(menchymal stem cells，MSCs)复合[6]，从而具有体内成骨能力[7]，可以作为支架材料应用于骨组织工程。血管内皮生长因子(VEGF)是一种具有特异性促进血管内皮生长和血管生成的诱导因子[8-9]，可以明显促进成骨细胞的增殖[10]，加快骨折的修复[11]。但由于VEGF半衰期短(＜6 min)，代谢降解过快，不能在局部形成有效浓度[12]，限制了其在临床中的广泛应用。科研人员发现VEGF是一种能够与肝素(heparin HP)静电结合的碱性糖蛋白[13]，与肝素有高度亲和力[14]，研究表明，肝素对生长因子的释放具有显著延长作用[15]。根据生长因子的体内贮藏机制，从仿生学角度出发，肝素亲和性生长因子的控制释放载体通常可设计成结合有肝素的天然或合成聚合物水凝胶，包括胶原和明胶、纤维蛋白胶、纤维连接蛋白、透明质酸、海藻酸盐、壳聚糖等，可以提高生长因子的负载量，增强其活性，延长释放时间[16]。纤维连接蛋白(fibronectin FN)是细胞外基质的重要成分，是一种重要的桥接分子，可以和胶原、肝素等基质分子结合[17-18]，也可通过氢键以及范德华力等与材料表面非特异性结合[19]，从而改善材料的生物相容性[20]，实验组A、B结果表明FN可以提高细胞和材料的黏附率，也可促进成骨诱导后细胞的生长、分化。

本研究构建的VEGF缓释支架方法简单，可行性强，不但充分利用了所选用的细胞外基质蛋白的生物学特性，而且保留了nHAC原有的基本结构。FN-HP-VEGF由分子间共价健和范德华力相互作用后，形成较稳定的复合物，减少了VEGF的早期突释，后期随着FN的水解，分子间共价键和范德华力的减弱，VEGF缓慢持续的释放，该实验说明利用肝素与多种生物因子的特殊亲和性构建生物性缓释系统简单可行[21]。MSCs来源广泛且在体外可大量扩增，易定向诱导为成骨细胞，已成为骨组织工程最重要的种子细胞[22]。hMSCs成骨诱导后，种植于不同复合支架上，通过计算细胞黏附率、支架内的细胞数及扫描电镜观察，证实了((VEGF+HP)/(FN+nHAC))缓释支架复合支架更有利于细胞的黏附生长和分化，能使细胞表达更强的成骨能力：首先，FN修饰nHAC后，FN形成的三维网状结构显著提高了细胞在nHAC的粘附率，使支架上的细胞数量较多。其次，VEGF通过成骨细胞的Flt-1受体起作用，在体外培养成骨细胞可明显增加其增殖力[23]，随着VEGF的缓慢、持续释放，有力的促进成骨细胞的增殖分化。

总之，经HP将VEGF复合于FN表面修饰的nHAC支架上，达到了缓慢释放的目的，构建了带有生长因子缓释效果的复合支架，该支架能更好地促进成骨定向诱导的MSCs黏附和增殖，为后期进一步的体内实验奠定了基础。

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