宋世威 李 珍 刘厚诚 孙光闻 陈日远

（华南农业大学园艺学院，广东广州 510642）

冬瓜（Benincasa hispidaCogn.）为葫芦科一年生草本植物，起源于中国南部和印度，我国主要分布在广东、广西、湖南、福建、江苏、浙江、四川、湖北、安徽、河南、河北等省。节瓜（Benincasa hispidavar.chieh-quaHow）又名毛瓜、毛节瓜，是我国的特产蔬菜，主要分布在广东、广西、海南等地，在北方部分地区作为特菜栽培。节瓜是冬瓜的一个变种，两者的亲缘关系较近。前人从生物学性状研究了冬瓜和节瓜的种质资源（李文嘉 等，1996；谢大森 等，2009），但由于两者的遗传背景较狭窄，同名异物或同物异名现象非常普遍，仅利用生物学性状进行区分和鉴定有较大难度。

RAPD分子标记技术由于产物的多态性较强，广泛用于葫芦科作物，如黄瓜（Horejsi & Staub，1999；李锡香 等，2004）、南瓜（Gwanama et al.，2000；李俊丽 等，2005）、西瓜（Zhang &Rhodes，1993；郭军 等，2002）、丝瓜（夏军辉和向长萍，2008）、瓠瓜（高山 等，2007）及西葫芦（陈凤真和何启伟，2010）等的遗传多样性研究，而关于冬瓜和节瓜种质遗传多样性的研究较少（陈清华 等，2003）。本试验利用RAPD技术分析41份冬瓜和节瓜栽培品种的遗传多样性，探讨其亲缘关系，为冬瓜和节瓜种质资源评价和良种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2008年3～6月在华南农业大学蔬菜试验基地进行。供试冬瓜和节瓜材料共41份，其中冬瓜18份，节瓜23份，均为商品种，供试材料名称、来源及农艺性状见表1。供试种子用55～65 ℃温水浸泡8 h后，置于30 ℃培养箱中催芽，待芽长0.5 cm时播于育苗盘中，植株长至4～6片真叶时取样。

表1 供试材料名称、来源及农艺性状

续表

1.2 DNA提取和RAPD分析

采用改良的CTAB法提取冬瓜和节瓜总DNA（Aljanabi & Martinez，1997），用紫外分光光度计在260 nm和280 nm处测定OD值，以检测DNA的质量和浓度，稀释到5 ng·μL-1作为PCR扩增的模板。

经正交优化确定冬瓜和节瓜RAPD的最佳体系:25 μL反应体系中含1×buffer，模板DNA 20 ng、Mg2+2.0 mmol·L-1、dNTPs 0.24 mmol·L-1、引物 0.3 μmol·L-1和Taq酶 1 U。最适宜的退火温度是36.9 ℃。PCR扩增程序:94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，36.9 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共40个循环，72 ℃延伸10 min。反应结束后，PCR产物在含0.5 μg·mL-1EB的1.8 %琼脂糖凝胶中电泳2 h，用Bio-RAD凝胶成像系统进行拍照分析。

1.3 聚类分析和主坐标分析

将电泳图谱清晰且可重复的DNA条带记为1，同一位置上的弱带且不重复或未出现条带的记为0，形成1和0数据矩阵，利用NTSYSpc（2.10）数据分析软件进行聚类分析和主坐标分析。用SimQual程序求相似性系数矩阵，用SAHN程序中的UPGMA方法进行聚类分析；用DCENTER程序进行系数矩阵转换，并用EIGEN程序求特征值和特征向量进行主坐标分析，用Tree plot模块生成聚类图，构建分子进化树，用3Dplot生成主坐标图。

2 结果与分析

2.1 冬瓜和节瓜DNA的RAPD多态性分析

从455条随机引物中筛选出能够产生稳定、清晰多态性扩增谱带的23条引物，23条引物对供试的41个冬瓜和节瓜种质共产生143条扩增谱带（引物序列及扩增结果见表2），其中多态性谱带81条，多态性检测率为56.6 %，平均每条引物产生6.2条谱带。图1、2分别为引物AX09和M16对41份种质基因组DNA扩增的RAPD带型。

不同引物扩增的谱带数不同，其中扩增谱带数最多的引物是 E03，扩增出 11条，其中多态性谱带7条；扩增谱带数最少的引物是AT08，仅扩增出2条。引物F09扩增谱带的多态性比例最高，达到88.9 %，AX05和AY16的最低，仅为20.0 %（表2）。

表2 筛选出的引物序列及扩增结果

图1 引物AX 09对41份冬瓜和节瓜种质基因组DNA扩增的RAPD带型

图2 引物M16对41份冬瓜和节瓜种质基因组 DNA扩增的RAPD带型

2.2 聚类分析

利用143条RAPD扩增谱带，用UPGMA法建立了41份冬瓜和节瓜种质间的遗传关系聚类分析图（图3）。聚类分析结果表明，41份种质间的遗传相似系数在0.60～0.99之间。25号材料粤农丰节瓜和30号材料粤农6号节瓜的相似系数达0.99，表明两者的亲缘关系非常近，田间农艺性状完全一致，说明这两个品种是同物异名；3号和5号两份材料商品名均为特大粉皮冬瓜，但两者的相似系数较小，为0.72，田间农艺性状也有较大差别，说明这两个品种是同名异物。在遗传相似系数0.71处可将供试的41份种质划分为6大类群9个亚类。

第Ⅰ类只有1份材料——特大粉皮冬瓜（3号），来源河北，早熟，大果类型，果实长筒形，果皮白绿色，密被毛刺和白色蜡粉。

第Ⅱ类也只有1份材料——广利粉皮冬瓜（19号），来源广东，中晚熟，大果类型，果实扁圆柱形，果形指数小于1，果皮白绿色被厚粉。

第Ⅲ类包括2份节瓜材料——长身黄毛节（16号）和5号黑毛节（17号），来源广东，早熟，果实长圆柱形，果形指数大，果皮表面星点多。

第Ⅳ类包括 5份材料，可分为两个亚类。① 扬子江粉皮大冬瓜（2号）、粉皮冬瓜（4号）和特大粉皮冬瓜（5号），分别来源于江西、北京和河北，早熟和中晚熟，大果类型，果皮白绿色，蜡粉重。② 蓟农一串铃冬瓜（6号）和一串铃冬瓜（7号），分别来源于天津和北京，早熟，小果类型，果皮青绿色，果形指数较小。

第Ⅴ类包括8份材料，可分为两个亚类。① 台湾特大黑皮冬瓜（1号）、广东黑皮冬瓜（888）（13号）、碧玉出口节瓜（14号）、夏冠1号节瓜（15号）、广优1号节瓜（18号）和粤农6号节瓜（30号）。两份冬瓜分别来源于北京和广东，早熟，大果类型，果皮墨绿色；4份节瓜均来源于广东，果皮翠绿或深绿色。② 黑先锋杂交大冬瓜（21号）和广东黑皮冬瓜（22号），来源于广东，早熟，大果类型，果实长圆柱形，果皮墨绿色。

第Ⅵ类包括24份材料，可分为两个亚类。① 一串铃4号冬瓜（8号）和精选一串铃冬瓜（35号），均来源于北京，小果类型，果实高桩形，果皮青绿色。② 其余22份材料，包括5份冬瓜和17份节瓜。

图3 41份冬瓜和节瓜种质的RAPD标记聚类图

2.3 主坐标分析

对RAPD标记所获得相似系数矩阵进行主坐标分析，第一、第二和第三个主坐标方差贡献率分别为32.06 %、9.17 %和7.52 %，累计方差贡献率48.75 %。41份冬瓜和节瓜种质在第一主坐标方向上被分为3类，在第二主坐标方向上被分为2类，将第一和第二主坐标作用综合起来考虑可将41份冬瓜和节瓜种质分为6大类群（图4），这与聚类分析结果相近。

第Ⅰ类，一串铃4号冬瓜（8号）和精选一串铃冬瓜（35号）；第Ⅱ类，特大粉皮大冬瓜（3号）；第Ⅲ类，扬子江粉皮冬瓜（2号）、粉皮冬瓜（4号）、特大粉皮冬瓜（5号）、蓟农一串铃冬瓜（6号）和一串铃冬瓜（7号）；第Ⅳ类，台湾特大黑皮冬瓜（1号）、广东黑皮冬瓜（888）（13号）、黑先锋杂交大冬瓜（21号）、广东黑皮冬瓜（22号）、碧玉出口节瓜（14号）、夏冠1号节瓜（15号）、粤农节瓜（20号）、长身黄毛节（16号）和 5号黑毛节（17号）；第Ⅴ类，广优 1号节瓜（18号）和广利粉皮冬瓜（19号）；第Ⅵ类包括22份其余种质。

图4 41份冬瓜和节瓜种质二维主坐标图

在第一、第二主坐标分组的基础上，结合第三主坐标，41份冬瓜和节瓜种质可分为 6大类群10个亚类（图5）。第Ⅰ类分为2个亚类:① 一串铃4号冬瓜（8号）；② 精选一串铃冬瓜（35号）。第Ⅱ、第Ⅲ和第Ⅴ类在第三坐标方向上没有再细分，说明第一、第二主坐标的信息足以将其区分开。第Ⅳ类分为2个亚类:① 长身黄毛节（16号）、5号黑毛节（17号）、粤农节瓜（20号）、碧玉出口节瓜（14号）和广东黑皮冬瓜（22号）；② 台湾特大黑皮冬瓜（15号）、广东黑皮冬瓜（888）（13号）、黑先锋杂交大冬瓜（21号）和夏冠1号节瓜（15号）。第Ⅵ类分为3个亚类:① 粤农208节瓜（37号）、七星节瓜（38号）、新会七江黑毛节瓜（39号）、特选种黑毛节瓜（41号）和江门利隆8号杂优连环节瓜（40号）；② 旺优七星节瓜（31号）、为农高产节瓜（32号）、为农节瓜（33号）和粤冠节瓜（34号）；③ 其余13份材料。

图5 41份冬瓜和节瓜种质的三维主坐标图

通过比较图 3、4、5可知，对 41份冬瓜和节瓜种质进行的系统聚类分析和主坐标分析的结果基本一致。

3 结论与讨论

从本试验结果来看，采用RAPD技术对冬瓜和节瓜种质资源进行多态性分析，构建了41份冬瓜和节瓜种质的聚类分析图和主坐标分析图，表明RAPD技术能有效地检测冬瓜和节瓜材料间的遗传变异，对其遗传多样性分析是可行的。

本试验中采用聚类分析和主坐标分析所获得的结果基本一致。特大粉皮冬瓜（3号）单独为一类，扬子江粉皮冬瓜、粉皮冬瓜、特大粉皮冬瓜（5号）、蓟农一串铃冬瓜和一串铃冬瓜为一类，这与聚类分析结果一致；丰青1号是冬瓜和节瓜兼用品种，在主坐标分析中表现出与湖南的冬瓜种质和部分节瓜品种较近的亲缘关系；一串铃4号冬瓜和精选一串铃冬瓜在主坐标分析中也被分到2个亚类。冬瓜和节瓜的分子标记与种质的果实大小、性状和果皮颜色密切相关。

系统聚类分析能提供丰富的数量信息，量化地体现冬瓜和节瓜种质之间的关系。主坐标分析能从不同的方向和层面更直观地提供更多的关于冬瓜和节瓜各种质或群体的关系。因此，将聚类分析和主坐标分析结合起来使用，可以互相印证和补充。在遗传距离计算方法一致的情况下，采用主坐标分析方法，对阐明冬瓜和节瓜间的亲缘关系能提供更全面的信息。

RAPD分析结果显示，冬瓜和节瓜最终没有聚成两大类，而是互有交叉地分散到6大类群中。这表明冬瓜和节瓜的亲缘关系很近，从分子水平上进一步证明其属于同一个种的不同变种。冬瓜各品种的相似系数多集中在0.60～0.80之间，而节瓜各品种的相似系数多集中在0.80～0.99之间，表明冬瓜的遗传多样性大于节瓜。这与两个物种材料的来源密切相关，冬瓜分布范围广，供试的18份材料来源于7个省；而节瓜主要分布在华南地区，供试的23份材料全部来自广东，遗传背景狭窄。

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