王 蕾 侯永清 丁斌鹰 刘玉兰 朱惠玲

仔猪断奶日龄越早，免疫系统功能越低，越易受病原体的感染。当断奶仔猪在病原体和非病原体等大分子物质的刺激下，免疫系统活化，被激活的单核巨嗜细胞系统会释放出一系列细胞炎性因子（如IL-1、IL-6、TNF-α），这些细胞因子不仅是参与免疫防御的主要活性物质，使动物处于免疫应激状态，而且能通过改变体内激素水平或对靶组织的直接作用来调节免疫应激过程中机体内养分的代谢[1]，使机体内营养物质从支持生长发育转向为支持与免疫系统活化有关的过程。日粮中添加α-酮戊二酸（AKG）能在一定程度上改善断奶仔猪的生长性能[2]。

本试验研究AKG对LPS刺激仔猪血液生化指标、血液激素水平和炎性因子水平的影响，旨在探讨AKG是否可缓解LPS所导致的应激反应。

1 材料与方法

1.1 试验材料

α-酮戊二酸（AKG）：市售兽医药级产品，纯度≥99.0%。

脂多糖（LPS）：Sigma公司提供，大肠杆菌血清型O55:B5。

1.2 试验动物与试验设计

选用24头健康的（24±1）日龄断奶仔猪[杜×长×大，体重（7.25±0.23）kg]，随机分成 3 个处理组（空白对照组、应激对照组、AKG组），每个处理8个重复，每个重复1头猪。各组基础日粮一致，空白对照组和应激对照组饲喂基础日粮，AKG组饲喂基础日粮+1%AKG。试验期为16 d。于试验第10、12、14和16 d清晨，禁食状态下，应激对照组和AKG组仔猪分别腹膜注射80 μg/kg BW的LPS，空白对照组注射相应剂量的灭菌生理盐水。

1.3 日粮组成

基础日粮配制参照NRC（1998）猪的营养需要（10～20 kg），基础日粮的组成及营养水平见表1。

表1 基础日粮组成与营养水平（风干基础）

1.4 饲养管理

猪舍为全封闭式，屋顶以排气扇通风，试验期间猪舍保持温度为22～25℃。试验猪在代谢笼中饲养，自由采食，乳头式饮水器饮水，猪舍定时清扫和消毒。

1.5 血浆样品采集

分别于试验第10、16 d注射LPS或生理盐水后3 h，用肝素抗凝真空管从仔猪前腔静脉采血，静置15 min后，3 000 r/min离心10 min，取上清液得到血浆，分装后-80℃保存待测。

1.6 测定指标与方法

1.6.1 血液常规生化指标

取出冷冻保存的血浆，采用日立7020全自动生化分析仪测定有关生化指标。测定指标与方法如下。

对水利建设单位加强管理，杜绝企业资质外借。各级水利部门要对水利建设企业进行严格管理，定期进行检查，统计企业所参与投标项目及其中标情况，同时根据企业实力核定其能从事的项目建设能力，帮助企业不断增强自身竞争力，遵守水利建设市场的规则规范。对外借资质的企业，一经发现，必须给予严厉处罚，可进行停业整顿或者禁止其1年内参与任何水利工程投标等。

①血浆总蛋白（TP）：双缩脲法；②血浆白蛋白（ALB）：BCG 比色法；③血浆球蛋白（GLO）：BCG 比色法；④血浆尿素氮（BUN）：酶偶联速率法；⑤乳酸脱氢酶（LDH）：连续监测法。

1.6.2 血液激素及炎性细胞因子水平

生长激素（GH）、生长抑素（SS）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子（TGF-α）、表皮生长因子（EGF）采用放射免疫试剂盒（北京华英生物技术研究所产品）测定。

1.7 数据处理

试验数据采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析和Duncan's多重比较，P＜0.05表示差异显著，P＜0.1表示具有显著性趋势。

2 试验结果与分析

2.1 AKG对LPS刺激仔猪血液生化指标的影响（见表2）

LPS首次应激时（第10 d）：①与空白对照组相比，应激对照组总蛋白含量显著下降（P＜0.05），应激对照组与AKG组差异不显著（P＞0.05）。②与空白对照组相比，应激对照组球蛋白显著降低（P＜0.05），和应激对照组相比，AKG组血浆球蛋白含量有所升高，但差异不显著（P＞0.05），同时，和空白对照组相比，AKG组差异也不显著（P＞0.05），介于两者之间。说明AKG在一定程度上缓解了血浆球蛋白含量的下降。③与空白对照组相比，应激对照组ALB/GLO 显著降低（P＜0.05），AKG 组没有差异（P＞0.05）；与应激对照组相比，AKG组ALB/GLO显著提高（P＜0.05）。

表2 AKG对LPS刺激仔猪血液生化指标的影响

仔猪经4次LPS刺激后（第16 d）：与空白对照组相比，应激对照组球蛋白显著升高（P＜0.05）、ALB/GLO显著降低（P＜0.05）；和应激对照组相比，AKG组球蛋白显著降低（P＜0.05），ALB/GLO 有所升高，但差异不显著（P＞0.05），同时，和空白对照组相比，AKG组ALB/GLO差异也不显著（P＞0.05），介于两者之间。

2.2 AKG对LPS刺激仔猪血液激素及炎性细胞因子水平的影响（见表3）

表3 AKG对LPS刺激仔猪血液激素及炎性细胞因子水平的影响

仔猪经4次LPS刺激后（第16 d）：与空白对照组相比，应激对照组EGF显著降低（P＜0.001），与应激对照组相比，AKG组EGF显著升高（P＜0.001）。

3 讨论

在LPS应激状况下，肠屏障受损，大量细菌和毒素经门静脉和肠系膜淋巴系统进入体循环，导致肠源性内毒素血症和细菌移位，并可引发炎症连锁反应，引起全身炎症反应综合征，出现如厌食、嗜睡和发热等症状。LPS通过刺激巨噬细胞（Mφ）合成和分泌白细胞介素（IL）-1、IL-6和 TNF（肿瘤坏死因子）-α 等炎性细胞因子发挥作用[3]。

3.1 AKG对LPS刺激仔猪血液生化指标的影响

血液生化指标的改变是组织细胞通透性发生改变和机体新陈代谢机能发生改变的反映。

仔猪血浆白蛋白由肝脏合成，是机体蛋白质的一个来源，可用于修补组织和提供能量。血浆球蛋白则是源于B细胞转化为浆细胞后分泌而成，能反映机体的抵抗力，总蛋白则是前两者之和。总蛋白在一定程度上代表了日粮中蛋白质的营养水平及动物对蛋白质的消化吸收程度。正常状态下的仔猪这3个指标维持在适度高水平可增强抵抗应激的能力而不影响生长性能。这三个指标降低通常是动物发生应激反应的标志之一，如鸡热应激的情况下，上述三个指标均显著下降[4]。

本试验结果表明，仔猪LPS刺激后，应激对照组血浆球蛋白先显著降低多次刺激后又显著升高。这说明LPS刺激对仔猪造成很大的应激。当仔猪在受到外界各种抗原（尤以日粮抗原与微生物抗原为主）的刺激，会激发免疫反应，短时间内会产生较高水平的抗体（球蛋白）用于抵制抗原；然而长时间的合成、分泌抗体必然会使日粮中用于生长的营养物质转向了免疫系统的合成来支持免疫反应，从而影响生长速度，甚至出现病态反应。日粮中添加1%AKG后仔猪血浆中球蛋白水平保持不变（AKG组和空白对照组相比差异不显著），这说明添加AKG能在一定程度上改善LPS导致的应激反应，提高仔猪机体的免疫功能。这与夏利宁（2004）[5]的研究结果相似。这可能是外源性AKG能作为肠道的能源物质，维持肠道屏障功能，减少细菌易位，促进营养物质吸收，可较好地保证血液中的抗体正常适度的合成和分泌，从而缓解了应激。

3.2 AKG对LPS刺激仔猪血液激素及炎性细胞因子水平的影响

生长激素（GH）是脑垂体前叶分泌的一种激素，是调控生长的核心，GH能促进生长，可促进蛋白质合成，且能调节体内的物质代谢，主要通过抑制肌肉及脂肪组织利用葡萄糖，同时促进肝脏中的糖异生作用及对糖元进行分解，从而使血糖升高。GH可促进脂肪分解，使血浆游离脂肪酸升高，使能量来源由糖代谢转向脂肪代谢。GH主要受下丘脑分泌的生长激素释放因子（GRF）和生长抑素（SS）的双向调节，其中SS是抑制垂体GH分泌的主要下丘脑激素，有资料表明，SS抑制GH的基础分泌，但只有在应激导致GH分泌过多时才显著发挥抑制作用[6]。SS的抑制作用最终表现为使机体代谢降低，动物生长受到一定程度抑制。本试验结果表明，LPS刺激后，各试验组血浆中GH和SS含量差异不显著（P＞0.05），显示AKG对GH和SS的分泌可能没有影响。AKG能有效缓解LPS刺激对杜长大断奶仔猪血液IGF-Ⅰ和胰岛素水平下降[2]。

表皮生长因子（EGF）广泛存在于体内众多组织中，尤以胃肠道为甚[7]，能刺激上皮生长。本试验首次发现AKG可以促进EGF的分泌（见表3）。本试验研究发现，LPS刺激可使血浆EGF含量降低，而日粮中添加1%AKG能显著缓解这种变化。EGF对维持胃肠道结构和功能的完整等方面具有重要作用，原因是EGF能促进肠道黏膜上皮细胞的增殖和分化，增强黏膜对养分的利用，减轻多种因素对胃肠道形态的损害。EGF对肠黏膜屏障的保护可能与其调节谷胺酰胺（Gln）的转运和小肠对谷氨酰胺的摄取和利用有关。EGF可明显促进谷胺酰胺的作用，使其发挥最大效用，并可持续刺激小肠蛋白合成[7]。TGF-α（转化生长因子-α）为EGF的同源物，也作用于EGF受体，是另一种胃上皮生长的调控因子。本试验研究表明，LPS和AKG对血浆中的TGF-α含量没有影响（P＞0.05）。

LPS通过作用于机体内的单核巨噬细胞，诱导该细胞合成和分泌多种介质分子，并借助这些介质分子在局部发挥作用，或随血液播散至机体其他部分而发挥作用。

IL-6和TNF-α是免疫细胞产生和释放出来的主要炎性细胞因子。TNF-α主要由单核巨噬细胞产生，而几乎所有器官中均有单核细胞存在。TNF-α不仅能介导LPS的多种生物学效应，而且通过诱导其它炎症介质的协同作用，扩大其生物学效应，从不同环节在体内产生炎性反应和组织损伤。许多研究结果证实，机体在受到LPS刺激后，体内TNF-α含量升高，这与本试验结果一致。本试验表明，与空白对照组和AKG组相比，LPS应激可使TNF-α含量显著升高，1%AKG可以有效抑制LPS刺激导致的血浆TNF-α含量上升。IL-6是一种具有多种生物学活性的细胞因子，主要由活化的T细胞产生和巨噬细胞产生[8]。IL-6在急性期反应中刺激肝细胞蛋白质合成，是一种内源性致热源，IL-6感染和组织损伤有关。因此，在感染和组织损伤中IL-6可作为一个预警指标。与Li等（2006）[9]研究结果相似，本试验发现，LPS应激可使血浆中IL-6水平升高，这可能是LPS刺激使机体免疫反应过度所致。1%AKG可以在一定程度上降低LPS刺激导致的血浆IL-6水平升高。AKG通过有效地促进氨的代谢机制，同时可转化成谷氨酸家族氨基酸（如合成Gln），从而减轻动物生产过程中的代谢应激，在一定程度上缓解LPS刺激导致的仔猪炎症反应。

4 小结

LPS刺激导致仔猪产生应激反应，而AKG在一定程度上缓解了LPS刺激导致的应激反应。

[1]Johnson R W,Propes M J,Shavit Y.Corticosterone modulates the behavioral and metabolic effects of lipopolysaccharide[J].The American Journal of Physiology,1996,270(1 Pt 2):192-198.

[2]刘坚，侯永清，丁斌鹰，等.α-酮戊二酸对脂多糖应激断奶仔猪生长抑制的缓解作用[J].动物营养学报，2009，21（4）：519-524.

[3]Johnson R W,von Borell E.Lipopolysaccharide-induced sickness behavior in pigs is inhibited by pretreatment with indomethacin[J].Journal of Animal Science,1994(72):309-314.

[4]刘铀，林红英，罗东君.热应激对肉鸡血液生化指标及内分泌机能的影响[J].湛江海洋大学学报，1999，19（1）：61-64.

[5]夏利宁，陶刚，王凤英，等.改进型中草药921合剂结合α-酮戊二酸对断奶大鼠肠道免疫的影响 [J].新疆农业大学学报，2004（27）：91-95.

[6]范志勇，王康宁，周定刚.生长抑素的作用及调控技术研究进展[J].中国饲料，2003（19）：5-7.

[7]赵允召.表皮生长因子对胃肠道的作用[J].国外医学：外科学分册，1993，20（4）：201-204.

[8]Lydyard P M,Whelan A,Fanger M W.Instant Notes in Immunology,Beijing:Science Press(copy),2000.

[9]Li J,Li D F,Xing J J,et al.Effects of β-glucan extracted from saccharomyces cerevisiae on growth performance, and immunological and somatotropic responses of pigs challenged with Escherichia coli lipopolysaccharide[J].Journal of Animal Science,2006,84:2374-2381.