高明春，李雪萌，张润祥，王君伟

（东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030）

碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）是一类非特异性磷酸单酯酶，可催化磷酸单酯的水解[1]。AP广泛存在于多种细菌、真菌及动物中。不同来源AP的分子质量大小、编码序列差异很大，而且各物种AP的性质、结构、功能与催化机理也不尽相同[2-3]。在这其中，大肠杆菌AP（Escherichia coli alkaline phosphatase，EAP）的有关研究最为透彻。EAP由ρhoA基因编码，为同源二聚体金属酶，单体由449个氨基酸组成，分子质量为47 ku，活性中心包括3个金属离子[4]。因EAP催化机理明晰，底物范围广泛，目前被作为信号酶而广泛应用于医学、免疫学和分析生物技术领域[5-6]。大肠杆菌ATCC 25922无致病性和耐药基因，在生物研究领域通常将其作为对照用标准大肠杆菌模式菌株[7-9]，但ATCC 25922 EAP的研究未见报道，其分子序列与酶活性等均属未知，本研究克隆并表达了来自大肠杆菌菌株ATCC 25922的EAP成熟肽基因，并对其进行了纯化以及功能研究，以期为ATCC 25922 EAP的研究与应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、载体和试剂

大肠杆菌菌株E.coli ATCC 25922、克隆宿主菌TG1为本室（东北农业大学动物医学学院微生物与免疫教研室）保存；纯品GoIFN-γ-ScFv-EAP蛋白（即EAP N端融合有抗鹅γ干扰素单链抗体的重组蛋白）本室制备并保存；表达宿主菌RosettaTM（DE3）pLysS、原核表达载体 pET-30a（+）购自Novagen公司；pMD18-T-simple、T4DNA连接酶、限制性内切酶购于大连宝生物工程有限公司；氨苄青霉素、卡那霉素、碱性磷酸酶底物对硝基苯磷酸（pNPP）购自美国Amresco公司。

1.1.2 引物

参照E.coli K12的ρhoA基因序列（Accession NO.CP000948.1），使用Primer Premier5设计并合成用于扩增EAP成熟肽基因的引物，即EAP1 5'GCAGGATCCCGGACACCAGAAATG 3'与EAP2 5'GAGCCTCGAGTTATTTCAGCCCCAGA 3'，分别带有Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位点。……