李业成，马凤鸣，吴 蕾，刘 成，王安娜，王婵婵

（东北农业大学农学院，哈尔滨 150030）

农业生产实践表明，非禾谷作物连作，将会出现发育不良，病虫害严重，以致于严重减产。因此,非禾谷类作物连作障碍已是农业生产上亟待解决的一大难题[1]。连作障碍（Continuous cropping obstacles）是作物栽培中的一种普遍存在的问题。黑龙江省作为我国大豆主产区，大豆种植面积广，连作问题严重[2-4]。探讨连作导致大豆减产的因素及解决连作带来的生产障碍问题已成为国内外研究关注的焦点。根系分泌物是植物在生长过程中通过根的不同部位向基质（土壤、营养液等）中溢泌或分泌的一组种类繁多的物质。阎吉昌指出，在连作大豆体系的研究中存在很多不足之处[5]，例如对化感物质作用的选择性和专一性、对同一植物化感物质高浓度和低浓度时作用产生的差异化感物质多种成分之间产生的复合效应等。根系分泌物主要包括下列几种类型：渗出物、分泌物、粘胶质、脱落物[6]。为了进一步研究大豆根分泌物在大豆连作障碍中的化感作用，本文设置正茬土、连作两年土培养大豆，待15 d后，以二氯甲烷作为溶剂，提取大豆根系分泌物，对大豆种子萌发和胚根生长进行测试。并采用气质联用仪分析法分别对正茬、连作大豆幼苗根系分泌物的二氯甲烷提取物进行鉴定，进而分析提取物的成份差异，为进一步研究连作大豆根系分泌物的化感作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

采用大豆品种抗线4号。大豆正茬土、连作两年土均取自东北农业大学香坊农场。

1.2 根系分泌物的提取

1.2.1 幼苗土培

选择大小均匀、饱满的大豆种子，用蒸馏水浮选去掉瘪粒，然后用30%的H2O2进行消毒，分别选取20粒大豆种子，播种在装有正茬土、连作两年土的桶中（底部和侧面均打孔）。桶的规格为直径30 cm，高度40 cm。将桶置于光线良好的室外，注意桶中土的湿度，保持土为半湿润状态，并及时补充蒸馏水。

1.2.2 根系分泌物的收集

将培养了15 d的大豆幼苗，从桶中小心地将幼苗取出，用蒸馏水冲洗根部的泥土，冲洗3遍，最后用无菌水冲洗3遍，去除根表面吸附的离子以及根系分泌的其他物质。不要伤及根系，保证根系完整。将幼苗移至到6 L 0.5 mmol·L-1的CaCl2溶液中，在室内光线良好的条件下培养4 h（10：00～14：00）后，用500 mL二氯甲烷溶液提取根洗液3次，将提取液用滤纸过滤后，用真空旋转蒸发仪在40～45℃条件下浓缩至50 mL，再将提取液用0.45 μm滤膜过滤后，转移到储藏瓶中，保存在4℃低温冰箱中备用。

在本文里，用正茬土栽培条件下收集到的大豆根系分泌物称为正茬大豆分泌物，在连作两年土栽培条件下收集到的大豆根系分泌物称为连作大豆根系分泌物。

1.2.3 根系分泌物的分离鉴定

运用气质联用仪（岛津GC/MS-QP2010）检测大豆根系分泌物成分。采用电子轰击源，轰击电压70 eV，扫描范围M/Z30-500，扫描速度0.4 s扫全程。毛细管柱：SE-54（30 m×0.32 mm×0.25 μm），离子源温度200℃，进样口温度250℃，柱温50℃，以10℃·min-1程序升温至250℃。载气为He，流量为1 mL·min-1，不分流进样，进样量为1 μL。溶剂延迟时间3.0 min。人工分析并与NIST05谱库核对，确定各组分物质结构及名称。

1.2.4 生物检测

在直径为15 cm的培养皿中，铺三张定性滤纸（试验所用滤纸、培养皿等器具使用前均高压蒸汽灭菌（0.14 MPa，121℃ 20 min），分别加入正茬、连作大豆根系分泌物的提取液（RE）10.0 mL，（每皿含1株植株4 h的根系分泌物为1倍，含2株植株4 h的根系分泌物为2倍，含1株植株4 h的根系分泌物1倍稀释液为1/2倍），对照（CK）加入二氯甲烷试剂10.0 mL，各处理待溶剂挥发干后，加入蒸馏水10.0 mL，再将30粒经消毒稍膨胀（20 min）均匀一致的种子放到滤纸上，盖上盖，在25℃恒温培养箱中培养，每天加入1.0 mL H2O，保持滤纸为湿润状态。每天上午9：00记录种子萌发情况（以芽长超过种子长度计为发芽，发芽率为规定发芽时间结束时统计的各组发芽数与试验的种子数之间的比值），连续记录3 d。3 d后向培养皿中加入经盐酸消毒的石英砂100 g，补加不同浓度的两种试液5.0 mL，继续培养，以后每4 d补加一次蒸馏水5.0 mL。12 d后分别选取长势一致健康的大豆幼苗5株，进行初生根长度的测定。

化感作用抑制率（Inhibitory rate,IR）的测定参照文献[7]，IR（%）=（Ti-T0）/T0×100%，IR 绝对值的大小代表累加化感作用强度。式中，Ti为处理值，T0为对照值，当IR≥0时，表示促进作用，当IR＜0时，表示抑制作用。

2 结果与分析

2.1 大豆根系分泌物GC-MS鉴定结果

对正茬、连作大豆根系分泌物的二氯甲烷提取液进行GC-MS鉴定，结果表明（见表1、2），两种分泌物都检测出醇、酸、烃、酯、酚、苯、酰胺、萘、醛、酮类物质以及其他烃类衍生物。不同的是其中组分有较大差异。将两种条件下的根系分泌提取物成分进行比较，其中相同的成分有乙苯、邻二甲苯、苯乙烯、丙三醇、十二烷、苯丙噻唑、十四烷、5-甲基-十四烷、十六烷、二十四烷、十七烷、2，6，10-三甲基-十五烷、邻苯二甲酸二异丁酯等。连作大豆根系分泌物提取物中，（E）-2-丁烯酸、7，9-二甲基-十六烷、甲基-丁二酸、2-乙基-1-十二醇、二十烷、十一醛相对含量较高，而这些物质在正茬大豆分泌中未被检测到。这些物质在大豆连作中的化感作用有待进一步研究。

表1 正茬大豆根系分泌物GC-MS鉴定Table 1 Assay results of root secretion of soybean rotation by GC-MS

表2 连作大豆根系分泌物GC-MS鉴定Table 2 Assay results of root secretion of continuous soybean by GC-MS

续 表

2.2 大豆根系分泌物对大豆种子萌发和初生根生长的影响

最常用检测化感作用活性的方法是测定种子萌发率和初生根的生长情况。大豆根系分泌物的二氯甲烷提取液对大豆种子萌发和初生根的生长有很大影响。由表3、4可知，正茬、连作大豆根系分泌物对大豆种子萌发和初生根生长都表现出抑制作用，并随浓度增大抑制作用增强。与对照相比，正茬大豆根系分泌物1倍、2倍浓度处理对大豆种子萌发率表现出极显著的抑制作用，且处理间差异显著。1/2倍浓度处理对大豆初生根生长抑制作用不显著，1倍、2倍浓度处理对大豆初生根生长能达到显著抑制作用水平，其化感抑制率分别为18%、36.2%；连作大豆根系分泌物不同浓度处理对大豆种子萌发都表现出极显著抑制作用水平，且各处理间差异显著。1倍、2倍浓度处理对大豆初生根生长能达到极显著抑制作用水平，其化感抑制率分别为37.1%、52.6%。

表3 正茬大豆根分泌物对大豆种子萌发和初生根生长的影响Table 3 Effect of root secretion of soybean rotation on seeds germination and primary root growth

表4 连作大豆根分泌物对大豆种子萌发和初生根生长的影响Table 4 Effect of root secretion of continuous soybean on seeds germination and primary root growth

无论是正茬还是连作大豆根系分泌物对大豆种子的萌发和初生根生长都表现出抑制作用，抑制作用随浓度的增大而增大。在相同浓度处理下，连作大豆根系分泌物对种子萌发和胚根生长的化感作用要高于正茬。

3 讨论与结论

根系分泌物是传递化感效应的主要物质，次生代谢产生的根系分泌物中有很大一部分具有自毒作用，植物的生长环境发生改变或者处于逆境条件下，根系的分泌活动也会发生相应的变化。

本试验采用土培盆栽的方法，收集正茬土、连作土的大豆根系分泌物，并以二氯甲烷作为溶剂提取大豆根系分泌物，分别设置不同浓度处理对供试植物进行生物检测，结果表明，大豆苗期根分泌物产生的化感物质对“下茬”大豆幼苗的生长和某些生理活性均有显著影响。无论是正茬还是连作大豆根系分泌物对大豆种子的萌发和胚根生长都表现出抑制作用，并且随浓度的增大抑制作用而增强。在相同浓度处理下，连作大豆根系分泌物对种子萌发和胚根生长的化感作用要高于正茬。这与连作条件下分泌更多的化感物质作用有关。大豆连作种植条件下，根系分泌的物质的种类和数量都显著增加。

植物次生代谢产生的根分泌物主要用来适应不良环境，且根分泌物中包含很多化感物质，大豆苗期根系分泌物的二氯甲烷提取物有醇、酸、烃、酯、酚、苯、酰胺、萘、醛、酮类物质以及其他类衍生物等。本试验鉴定大豆根系分泌物并分析其成分，相同的成分有乙苯、邻二甲苯、苯乙烯、丙三醇、十二烷、苯丙噻唑、十四烷、5-甲基-十四烷、十六烷、二十四烷、十七烷、2,6,10-三甲基-十五烷、邻苯二甲酸二异丁酯等。连作大豆根系分泌物提取物中，（E）-2-丁烯酸、7,9-二甲基-十六烷、甲基-丁二酸、2-乙基-1-十二醇、二十烷、十一醛相对含量较高，而这些物质在正茬大豆分泌物中没有被检测到。连作大豆根系分泌的物质种类复杂，数量和性质上也有很大差异，利用有机溶剂提取的也只是其中的一部分，而且这些物质很可能具有化感作用，这些物质在大豆连作中的化感作用还需进一步研究。

[1]吴凤芝,赵风艳.根系分泌物与连作障碍[J].东北农业大学学报,2003,34(1)∶114-118.

[2]赵真真,左广胜,徐振同,等.重茬障碍的研究现状[J].中国农学通报,2008,24(7)∶186-190.

[3]张重义,林文雄.药用植物的化感自毒作用于连作障碍[J].中国生态农业学报,2009,17(1)∶189-196.

[4]张小玲,潘振刚,周晓雄,等.自毒作用与连作障碍[J].土壤学报,2007,38(4)∶781-784.

[5]阎吉昌.连作大豆化感作用研究[J].大豆科学,2002(3)∶214-217.

[6]吴凤芝,赵风艳,刘元英.设施蔬菜连作障碍原因综合分析与防治措施[J].东北农业大学学报,2000,31(3)∶241-247.

[7]Lawn X,Kim K U,Shin D H.Rice allelopathic potential and its modes of action on barnyard grass allopathic[J].2000,7(2)∶215-224.