徐广贤，周 晶，李 娟，贾 浩，王玉炯*

(1.宁夏大学生命科学学院，宁夏银川750021；2.宁夏医科大学检验学院，宁夏银川750004)

牛结核病是一种人兽共患传染病，可通过吸入含菌气溶胶或食用受污染的乳制品而传染人[1]。牛分枝杆菌(Mycobaeterium bovis)是引起牛结核病的病原体，其宿主广泛，可感染多种家畜和野生动物，对人类和动物的健康构成危害[2]。

研究表明，M.bovis的一些磷脂代谢途径，与其致病性有关[3-4]。溶血磷脂酶(Lysophospho lipase，LIP)主要催化溶血磷脂水解为磷酸甘油和溶血磷脂酸，是催化其失活的主要途径，被认为在调节生物活性脂质水平中起关键作用[5]。溶血磷脂是磷脂代谢的中间产物，通常呈低水平广泛分布于各种生物的细胞膜上，具有除垢剂样特性和溶膜特征，是一种很强的生物活性因子[6]。

为了研究LIP基因在M.bovis致病机理中的作用，本研究对M.bovis的LIP基因进行克隆、原核表达，为进一步研究其LIP的功能及其生物学效应奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料M.bovis菌C 68-2株由中国兽医药品监察所提供；表达载体pET30a及DH5α和BL21菌株由本实验室保存。

1.2 目的基因的克隆与重组质粒的构建 根据GenBank中登录的M.bovis的LIP基因核苷酸序列，用primer 5.0软件设计引物，并由上海Sagon公司合成。上游引物LIP-S：5'-ATATGGTACCGAGCAT GCCCGCCGCTACGAC-3'；下游引物LIP-AS：5'-GT ACGAGCTCCTACAACCGCTCGGTGAGCCAG-3'(下划线分别为KpnⅠ和SacⅠ酶切位点)。

采用CTAB方法提取M.bovis基因组DNA[7]，以其为模板，参照ExTaqPCR试剂盒(TaKaRa)对LIP基因进行PCR扩增。PCR反应总体积为50 μL。PCR程序：95℃ 3 min；95℃ 1 min、60℃ 1 min、72℃1 min，30个循环；然后72℃ 10 min。反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用EZ-10Spin Colunm DNA Gel Extraction试剂盒回收740 bp左右DNA片段，经SacⅠ和KpnⅠ双酶切后，与用经过同相双酶切的pET30a(+)连接过夜，转化到BL21(DE3)感受态细胞中，并命名为pET30a-LIP，并对目的基因进行测序鉴定。……