冯书堂

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193）

近交系实验动物基因高度纯合，能象物理学研究中的精密仪器和化学反应中的分析纯试剂那样，为生物医学及生命科学研究提供灵敏的、偏差极小的实验结果。为满足人类生命科学研究的需求，国际上已培育出近交系小鼠388个、近交系家兔34个。但因大型动物繁育生理等诸多方面与小型动物不同，至今国内外未见成功报道（中国农业科学院科技信息中心查新,2009）。利用我国小型猪遗传资源创新培育近交系小型猪，近交系猪培育成功作为人类“替难者”，将会有力地推动生命科学尤其是人类医学、异种器官移植应用研究的发展。因此，利用我国小型猪遗传资源创新实现近交系猪培育目标，有着重要的现实和历史意义。

1 开阔视野、奋力探索、实现小型猪遗传资源的创新

我国改革开放初期，1983年研究者在西德学习时，有幸参观西德哥廷根小型猪（GottengenMinieturePig）育种中心，了解到该品种是通过“三品系”杂交等措施、历经十多年培育而成的遗传资源创新--哥廷根小型猪，并已销售到多个国家和地区，大量应用于人类多种疾病动物模型。于是产生了引种回国开发应用的念头，但由于种种原因未能实现。在此期间，国内经历了大规模的家畜品种资源调查，发现了我国地方小型猪品种资源十分丰富，据不完全统计有六、七种，例如：香猪、五指山猪、滇南小耳猪、合作猪、藏猪等[1]。五指山小型猪（WZSP）就是其中一例，但已濒临灭绝（见1987年7月原中国农业科学院畜牧研究所冯维奇研究员、原广东省畜牧研究所王正研究员等十七人参加的考察报告）。从资料和定点观测数据上分析，WZSP的小型化特征、遗传稳定性要远远好于西德哥廷根小型猪，具有较好的应用前景。

WZSP素称“老鼠猪”[2]，原产我国海南省中南部山区。上世纪60年代存栏10万头，70年代存栏600头，80年代初仅发现纯种10余头。如此迅速濒临灭绝，主要原因是其体型小、肉质好、没有养公猪习惯、近亲繁殖、产量极低，引进大体型肉用品种杂交改良“换种”而造成的。为挽救这一濒灭猪种，从1987年起就开始了原地保种、定点观察，本项目培育的近交系，就是从原产地定点观察后、仅存留的同窝的1公1母近交繁育而成的。当时对该品系的研究仅限于一般的繁殖、生长发育性能观察，对其种质特性、有何开发应用价值一时还很难说清。将其培育成为理想的、近交系实验动物，需开展大量的研究工作。

中国农业科学院畜牧研究所原在1987年就成立了以冯书堂助理研究员为首的小型猪课题组，初步制定了培育研究技术路线：①采用“仔母配”和“全同胞配”等近交、实验化培育；②近交鉴定研究；③遗传稳定性、矮小性以及与人类近似性研究；④品系、品种间鉴定方法等研究等。为培育近交系猪实现资源创新奠定了基础。20年来，经历了研究者冒雨产地山区寻找的困苦、白云山机场托运的磨难、屡配不孕的困惑、卧息猪圈等待产仔的艰辛、近交带来“三高一低”不良影响的焦虑、因保种负债累累、惨淡经营、而限制自我发展的无奈，更主要的是部、院、所领导重视、成功自信的喜悦和责任。

2 近交系小型猪遗传资源创新取得的成就

2.1 由2头猪建立近交系群体，确立为国家第一批畜禽遗传保种场（C1101001）

目前已组建WZSP近交繁育群、三个家系基础母猪群230头、公猪20头、F20近交系数高达0.986；培育的近交系较之原始种猪群具有性情温顺、遗传背景清楚、基因高度纯合、体色为黑白花、体型和毛色一致等特点，较之国内外品种更具有体型小、遗传稳定等优势。培育的新品系与原始品种从宏观体色、体型到微观等位基因的多态性已有本质的不同。

2.2 建立近交系培育技术方法[2]，授权发明专利（ZL02149030.9）

图1 F16公猪

图2 F14种猪群

图3 F16母猪

图4 原引种猪

图5 原始种猪群

图6 原始种母猪

利用同窝的1公1母WZSP为系祖，采用“仔配母”、“全同胞交配”结合分子遗传标记、诱导发情、提高营养水平、定期舍外运动等综合措施，最大限度的提高近交速度，最大限度提高群体基因的纯合度、淘汰有害基因。逐步克服“三高一低”不良影响（成活率低、木乃伊和弱仔率高、死亡率高、断代率高）；培育出了具有世界领先水平的近交系猪种群，F20近交系数高达0.986，具有体型小、基因高度纯合；通过500头次数据分析表明近交对繁殖力影响很大，F8～F9仔猪成活率极低、分别为19.05%、22.22%,并伴有发情不排卵、屡配不孕、断代等现象。为解决这一难题，采取PMSG+HCG“诱导发情”、提高饲料营养水平（即：由13%的蛋白水平提高到20%）、定期舍外运动（效仿原生态环境）等措施，逐步克服近交对其繁殖力“三高一低”的不良影响。但随着近交代数的推进，其仔猪成活率逐渐提高，断代、死胎、木乃伊比例逐渐降低，窝产仔数亦有增加的趋势。如F14窝产仔数为5.75±1.00，仔猪成活率为66.67%，死胎、木乃伊率为6.06%；并获得近交F20，仔猪成活率达到80.0%以上（普通环境下）。培育的近交系较之原始种猪群具有性情温顺、遗传背景清楚、基因高度纯合、体色为黑白花、体型和毛色一致等特点（见图1-8），较之国内外品种更具有体型小、遗传稳定等优势；其近交系数高达0.986；依据微卫星探针对F15个体在S0036等三个位点等位基因的纯合度不同将群体分为三个家系。其近交系培育方法已获国家发明专利（ZL02149030.9）。

2.3 高寒地区引种扩繁，证明了我国近交系品种猪培育成功的可靠性

2002年10月26日，与延边农科院签定了“仅限于进行肉食开发”引种协议，向其提供1公4母，截至2008年12月20日，6年内已产仔1600余头，每年提供开发烤乳猪500余头，现存拦426头，其中262头基础母猪群、后备母猪53头、种公猪16头，商品猪95头（见延边农科院2008年12月20日向我所提供的“繁育及开发情况”报告）。证明五指山猪近交系已跨越近交死亡节段，近交系品种在中国已培育成功。

2.4 近交多方验证、揭示其遗传稳定性分子基础[3]

依据世代DNA指纹图相似系数、微卫星分析、皮肤移植等方法进行近交多方验证：①微卫星探针监测证实：近交F8、F8-F9、F9-F10、F10个体间DNA指纹图相似系数分别为0.678、0.785、0.855和0.906。表明随着近交代数的推进其DNA指纹图相似系数越来越高；9对微卫星探针对其F14、F15、F16群体检测表明：随着近交世代的递增，群体的遗传变异性降低，其家系Ⅱ的平均杂合度及平均多态信息含量分别为0.2075和0.1588，其值小于0.25、基因已高度纯合。

华西医科大学研究发现WZSP近交系F8群体DNA指纹图相似系数（0.86）等同西双版纳小型猪近交繁育的F12（0.86）；孟安明等报导原引的2头猪个体间DNA指纹图相似系数已高达0.698。这一研究结果更为准确的判断WZSP近交代数的推进提供了科学依据。

②利用PNAS-4(MspI)等10个SNP位点对三个品系小型猪检测，其中9个SNP位点中，WZSP近交系有6个纯合，广西巴马小型猪（以下简称：GXMP）和贵州小型猪（以下简称：GZMP）各有2个纯合。表明WZSP近交后基因已高度纯合。

③揭示了近交系猪等位基因的变化规律类同近交系小鼠。研究了F13-F1874头近交系猪个体在14个具有多态性微卫星位点等位基因的变化规律，共发现38个基因，平均每个位点2个，大大低于海南五是山猪核心群每个位点9.63-14.93个（王兴龙,2005），其中3个等位基因较早纯合，多数等位基因随近交代数提高逐步纯合，少数2-3个等位基因始终处于高度杂合状态（0.59-0.68）,可能是该品种生命所必需的，我们称之为“生命基因”。

④对广西、贵州小型猪和WZSP近交系小型猪三品种的Y染色体、线粒体DNA特异标记研究结果表明，WZSP近交系个体间相似性最大。

⑤皮肤移植检测试验

皮肤移植试验是检测和判断近交系实验动物最有说服力的证据之一。同解放军304医院、北京医科大学合作开展了WZSP近交系皮肤移植试验，F14和F19个体间进行的皮肤交叉移植试验未见急性排斥反应发生。表明WZSP的近交繁育已达到相当高的水平。

上述研究结果，从分子遗传学深层证实了WZSP近交培育的可靠性、遗传稳定性，为其近交繁育体系的建立提供了科学的理论依据，并揭示了其遗传稳定性的分子遗传机理。

2.5 建立了近交系小型猪与我国其它小型猪品系、品种间的鉴定方法和标准

通过蛋白质检测、微卫星和线粒体DNA分析、SRY等基因的SNP分析等分子生物学手段，发现WZSP、贵州、广西巴马小型猪在11个微卫星位点上分别有22、49、25个等位基因可作三品系种间的鉴定；AKP蛋白质标记AA型和SW93688bp为WZSP近交系特有遗传标记、并已授权国家专利(200510008994.2)，亦可作与其三品系种间的鉴定手段之一。

2.6 初步揭示近交系小型猪其矮小型分子遗传机理[4]

我国WZSP近交系具有矮小型特征，通过GH、GHR等基因分析，发现其GH、GHR基因序列与普通猪不同、类似侏儒人，为其成为理想的医学模型提供科学依据。如：研究发现WZSPGH基因(登录号:DQ415717)两个位点突变，引起编码氨基酸的改变；GHR基因(登录号:DQ422962)其胞内结构域五处突变，可能对GHR的胞内信号转导产生一定的影响，从而影响GH-GHR-IGF-Ⅰ内分泌生长轴信号传递，削弱生长激素的促生长作用；同人的Laron综合症由GHR的缺陷导致GH信号转导中断取得一致性的结果。

2.7 初步揭示近交系小型猪与人类免疫同源性分子遗传机理[5、6]

MHC基因决定人和动物种群和个体间是否发生免疫排斥反应。人的MHC称HLA、猪则称SLA，MHC基因群分为三大类,其中Ⅰ、Ⅱ与免疫密切相关，SLA与HLA越相近、越适合猪→人器官移植。通过对我国WZSP实验用小型猪SLA分析发现，SLA-Ⅰ类基因有10个新的等位基因（登录号:DQ399654等)，在3个关键氨基酸残基上与人的完全相同；SLA-Ⅱ类基因中发现DRA、DRB、DQA、DQB等基因与人类亦有较高的同源性（75%～100%）等。研究还证实三个品系小型猪42种血液生理生化值、生理解剖、器官大小、代谢等近似人类，较之哥廷根小型猪和普同家猪更近似人类[3]；上述研究结果初步揭示我国实验用小型猪与人类免疫同源性分子遗传机理，并为研究解决异种器官移植排斥反应提供参考数据。

2.8 近交系小型猪内源性逆转录病毒（PERV）生物安全性研究

协作组章金钢教授等在国内首次对小型猪进行内源性逆转录病毒（PERV）的群体检测[7]，先后对8个品系群体检测10次达3000余头次。获得了WZSP实验用近交系PERV前病毒全长克隆、序列测定并登陆GenBank（序列号EF133960），首次证实WZSP近交系PERV-A型（74.43%）的表达率低于B型（95.40%），未检测到PERV-C型的存在与表达，这降低了具有较强感染能力的A/C重组毒出现的可能性,为今后筛选A、B型低表达个体或品系，减少猪异种移植物的PERV基因序列负荷、降低猪异种移植排斥反应的发生，提供宝贵的材料和科学依据。该近交系小型猪无PERV-C、部分个体不含PERV-A型等，可能是长期近交使PERV-C基因片段和部分PERV-A基因片段丢失造成的。

2.9 开展了近交系小型猪SPF净化研究[3、8]

利用剖腹取胎、无菌接产、胚胎移植三种净化方法，对WZSP近交系等三品系进行了净化研究获得成功[9]。经农业部兽医疹断中心和北京市兽医疹断中心检测证明：培育的WZSP近交系种群无猪瘟、口蹄疫、猪丹毒、猪肺疫、细小病毒病、伪狂犬病、传染性胃肠炎等七种病毒病，无喘气病、萎缩性鼻炎、痢疾、布氏杆菌病、传染性胸膜肺炎等五种细菌病原以及皮藓、螨虫等三种病原，获得净化种猪群体。制定了小型猪SPF饲养管理实施方案，总结出“净化技术操作程序”技术规范。不仅为我国实验用小型猪SPF培育和应用提供技术支撑。而且可为今后我国种猪净化提供更加经济、便利的新措施。经检测合格获得实验动物屏障环境和普通环境使用许可证。

此外，深入研究和和掌握生长发育规律、获得生理生化等指标、并对WZSP进行了生理解剖学研究，为其奠定开发应用基础，建立了与近交系猪相批配的比较规范的饲料配方和标准。为首次制订了国家、地方实验用小型猪遗传、营养、微生物标准（草案）提供了科学依据。

3 国家重视、多方资助与合作

中国农业科学院畜牧研究所自1987年至今，历经20余年的努力，在农业部、科技部、国家自然科学基金委、北京市科委等先后资助下，从我国体型小、濒临灭绝的珍稀品种五指山猪中，分离、培育出世界上首批近交系猪。累计投资1500万元，先后列为“七五、八五、九五”农业部畜牧重点：五指山小型猪选育、育近交系五指山小型猪培育与开发利用，实验用小型猪的选育（1987～1993年，3870087，业187-1-14），国家畜禽资源保种场项目（2000、2002、2004、2006、2007、2008），国家五指山猪保种场建设项目（2003-2004）；国家自然科学基金重点项目：五指山猪实验用近交系的建立（39830190）、国家自然科学基金重点项目：适于用异种器官移植猪基础性研究（39830190）；科技部社会公益性重点专项：我国小型猪实验化培育与生物安全性研究(2001DIA40036)；科技部科技基础性工作和社会公益研究专项：五指山猪近交系及油鸡资源保存和利用研(2003DEB6J078)；科技部“863项目：用于异种器官移植五指山小型猪SLA及EG细胞建系研究（2003AA215103）；以及科技部“十五”攻关项目、中国实验用小型猪资源开发与研究应用（2004BA717B）；北京市科委2007项目、“实验用小型猪地方标准研究（D07080200720701）”等十余项。先后同贵阳中医学院、广西大学、中国农业大学、农业部兽医诊断中心、上海交通大学、军事医学科学院等相关单位，开展了一系列的合作研究，包括：实验培育、种质特性测定[9、10]、分子遗传基础研究、以及其生物安全性研究、净化培育、我国实验用小型猪质量控制标准草案的制定等研究。

10余年来已累计向社会50多个单位提供上千头近交系小型猪，进行深层次、多方位的开发利用，已成功应用于动物疾病模型、烧伤皮肤敷料、新药检测、眼睫膜保存与异种移植、生物工程和食品安全评价等著多面，如：北京友谊医院、解放军309等单位的肝肾脏异种器官移植研究；北京口腔医科大学、天坛医院口腔研究所、武警总医院等单位的口腔疾病上的模型研究；北京阜外医院心血管病动物模型研究；北京同仁医院等单位的胰腺细胞异种移植、眼角膜保存与异种移植研究取得重要进展，眼角膜异种移植给猴子可存活280天以上；中国医科院新药安全评价研究中心、国家医药检测研究中心；解放军301总医院等的糖尿病动物模型；解放军304医院的皮肤烧伤动物模型研究；解放军309医院肾脏移植新药动物模型检测与鉴定；国家兽药检察总所、军事医学科学院的猪瘟、肠炎等疫苗制剂检测与鉴定；北京大学、中科院生化细胞研究所等小型猪胚胎干细胞建系研究[11]；军事医学科学院将WZSP用于战地救护一类止血新药实验成功后，已获得生产批号,立即投入生产等均有力的促进医学发展。并多次举行不同的研讨会、申报专利多项、获奖多项，使近交系小型猪取得长足的进展（详见附件1-3）

4 讨论

4.1 我国小型猪遗传资源的保种与利用途径

中国地方小型猪种的开发利用途径大致分为三大类，其中与我国普通地方种猪（大型猪）相同有两大类。

其中之一，利用体型小这一遗传资源特点，进行引种、封闭群培育、完成遗传、繁殖、生长发育、生理生化等指标测定后，直接上市提供实验动物。如原北京农大王连纯教授等1986-1987年先后从贵州、广西引种91头，贵州中医学院甘世祥教授引种香猪2公4母[12]，原广西农学院王爱德等1987年教授引种巴马香猪16头（2头公、14头母）[13]，此外云南农大、原上海农学院、原扬州农学院等单位先后利用此方式开展了小型猪遗传资源的保种与利用。此外，贵州利用香猪肉质好这一遗传资源特点，直接开发香猪烤乳猪、烤全猪，此利用方式类同普通地方种猪开发特优产品直接上市一样。如，华南小耳猪类的烤乳猪，金华火腿、莱芜猪大排、玉山猪红烧肉等。

图8 近交系猪性情较原始品种温顺

其中之二，进行杂交改良、实现遗传资源创新[14]。在此方面从宏观讲，利用地方种猪培育二元杂交（地方猪占50%）、三元杂交（地方猪占25%，）或新品种（品系）开发优质产品直接上市。由于其体型大、产肉量高，其开发和影响的力度远远大于、好于小型猪品种。但上海交通大学等也利用“巴马香猪×杜洛克”杂交此种研发模式，其后代了不仅肉质好、而且产量高、其优质肉产品也直接上市。就我国地方种猪采用杂交改良、培育出的杂交配套系、或新品种而实现遗传资源创新，以满足社会的需求所培育的北京黑、哈白、鲁来黑猪、苏太猪、新丹系黑猪、中育猪配套系、冀合白猪配套系、滇撒猪配套系[1、14]等而论，其群体近交系数一直均维持在2.50%以下。这种开发利用方式从现代基因工程技术层面上讲，就是通过品种间的杂交，使其等位基因杂合度增加、多态性提高、基因资源更加丰富。从而实现我国地方种猪遗传资源创新，是实现我国地方种猪有效保存和利用的永恒主题，也是我们祖先历经万般磨难经“人工选择+自然选择”、使其地方种猪种质资源才有如此丰富的原因所在。联系当前我国大规模的施实“转基因猪培育重大专项”研究，就可使我们更清析的认识到实现“种猪遗传资源的创新”理念。即，利用基因组辅助育种和转基因育种结合常规育种，培育家畜新种质资源的指导思想，家畜新种质资源的竞争和创新也是推动人类社会发展的表现形式。

其中之三，由于种猪遗传资源开发目的与用途不同，我国地方小型猪种的开发利用还存在另一种与我国普通家猪（大型猪）截然不同的途径和方式，那就是通过“近交繁育”、淘汰群体部份有害的等位基因、降低等位基因的杂合度和多态性，使之多数基因座等位基因的纯合，稳定表达单一性状，即将群体近交系数提高达98%以上，向“杂交改良、实现遗传资源创新、群体近交系数维持2.50%以下”的开发利用反方向研究目标发展。这样培育出遗传稳定的近交系小型猪，可做为研究、解决人类疑难疾病、研制新药产品、乃之今后异种器官移植需求供体理想的“替难者”。因此，培育“近交系品种猪”是实现遗传资源创新另一个途径。国家畜禽遗传资源委员会专家、南京农大王林云教授曾精辟、明确的指出[15]：“五指山小型猪近交系（WZSP近交系）是中国农科院畜牧所从1989年开始培育的将中国地方猪种用作实验动物的一个很好例子。它是从1987年开始在海南原地保种、定点观察后，最终存留的同窝的1公1母两头猪近交繁育而成的。----目前存栏250余头。已成为与原有五指山猪性能不同的一个新遗传资源。”

4.2 近交系小型猪急待开展的工作

1）我国应提倡遗传资源创新、敢于创新、科学创新，尽快建立近交系小型猪标准。目前国内、外还没有近交系小型猪、也就没有近交系小型猪的监测标准。因为一种动物遗传监测标准的制定需要很长的时间和众多使用这种动物的科学家从各个方面共同制定，如大小白鼠使用了很多年后才于1980年8月在国际实验动物科学委员会（ICLAS）会议、国际抗癌协会（UICC）等诸多团体的协助下，在东京正式成立了对近交鼠的遗传监控机构，有美、英、法、德、波兰、日本等各国研究这方面的专家学者共同制定国际监测标准。我国实验用小型猪研究已开展了30余年，随着近交系小型猪作为实验动物的学者提供详细的实验数据，可逐步建立我国近交系小型猪标准，进而促进我国近交系小型猪培育和研发工作的健康发展。也是培育合格的实验用猪满足社会的依据和需要。

2）培育合格的近交系实验用猪满足社会的需要:由于实验动物科学在医学发展中占有特殊地位，是生命科学的基础和重要支撑条件。在一定程度上，实验动物的质量决定了研究课题的成败，研究成果的可信性和科学性。随着小型猪在人类比较医学皮肤移殖、心血管疾病、消化代谢实验的应用，以及国家一类新药的研制、生产和监测量的增加，对实验猪的需求量会越来越大，小型猪需求量将会稳步增长。培育合格的实验用猪满足社会需要是首要完成的任务。

3）建立多种技术平台，满足社会需要:猪细胞人源化改造可用于人类疑难疾病的治疗。因此，开展实验用小型猪多种体细胞干细胞以及组织的保存，对其全方位、深层次的开发利用有着重要的意义。如建立皮肤、胰腺、骨髓、卵巢间充质、睾丸间充质、血液等干细胞系及分化技术平台。

4）挖掘我国实验用小型猪特有的等位基因及特性研究:我国小型猪种质资源丰富、特异性明显。因此，进行我国实验用小型猪特有的等位基因及特性研究，具有重要的理论和实践意义。研究内容包括：建立我国不同品系实验用小型猪高通量新基因发掘技术平台，发掘和克隆一批具有自主知识产权的重要新基因；建立的高效规模化转基因和多基因聚合技术体系；培育一批小型猪新型转基因生物新材料和新品种。将是我国实验用小型猪近期和中长期培育、开发利用应坚持奋斗的目标。

（其他文献可函索）

[1]《中国家畜家禽品种志》编委会.中国猪品种志[M].上海科学技术出版社，上海，1986.

[2]冯书堂，楮武军，王雅春，王端云.中国五指山猪[M].中国农业科技出版社，北京，1999.

[3]冯书堂.五指山小型猪实研用近交系培育研究成果[J].中国农业科学，2007，40：379-385.

[4]李吉涛.中国农业科学院博士学位论文“五指山猪近交系矮小性分子遗传基础研究”，2007，6.