陈 颖，曹福亮，徐彩平，汪贵斌，张往祥

不同部位银杏茎段培养及位置效应的研究

陈 颖，曹福亮，徐彩平，汪贵斌，张往祥

（南京林业大学森环院，江苏 南京 210037）

以一个月月龄银杏（）无菌幼苗各部位茎段为外植体，研究其顶芽、带腋芽的中段、带子叶的下段腋芽萌发和不定芽的分化情况。结果表明：①银杏顶芽段（上段）在以改良MS、N6、DCR为基本培养基，附加0.1mg/L NAA和0.5 mg/L 6-BA的培养基上顶芽生长较其他培养基好，抽出的芽苗长得高，最高达2.98 cm，未见有不定芽的分化；②中段外植体在四种基本培养基（MS、DCR、N6、改良MS）中附加0.1 mg/L NAA和0.5 mg/L 6-BA和0.25%AC时，都能诱导出腋芽和不定芽，4种培养基之间芽诱导率无明显差异，以N6培养基的诱导效果最好，平均每个外植体产生1.56个芽；③带有子叶下段的外植体培养后，能诱导出2 ~ 3个子叶腋芽和新的不定芽，在改良MS＋0.1 mg/L NAA＋0.5 mg/L 6-BA、N6＋0.1 mg/L NAA＋0.5 mg/L 6-BA培养基上两个腋芽的诱导率均达80%以上。表明，不同部位的银杏茎段在芽的诱导上存在位置效应，可利用不同部位进行银杏的定向快速繁殖。

银杏茎段；组织培养；位置效应

银杏（）由于其含有黄酮和萜内酯而倍受人们的青睐，银杏黄酮和萜内酯主要来源于银杏叶片，但含量很低。在土地面积日益减少的今天，借助于植物细胞的大量培养来工业化生产银杏次生物质代谢产物，是一条比较可行、又节省土地、实现集约化经营的途径。细胞培养的外植体来源一是来自于实生苗的叶片及幼茎；二是来自于试管苗的各组织器官。来自于实生苗的外植体只能在春季4－6月采集，且污染率大，不能常年供应愈伤组织的起始外植体。尽管细胞培养体系建立后也可以保持常年愈伤组织的增殖，但仍不能满足大量培养的要求。因此建立一个微型无菌的快繁体系可以为细胞培养、组织培养、遗传转化不断地提供原始材料，真正实现银杏细胞培养生产次生代谢物的大规模生产和银杏遗传转化研究。

在银杏的组织培养中，国内外学者对未成熟胚、成熟胚、子叶、茎段的分化有了一定的研究，但仍然存在分化难、分化数少、体系不稳定的问题。为进一步提高银杏的芽发生频率和减少偶然性因素，本研究以不同部位的银杏茎段为外植体，研究了不同培养基、不同调节剂对银杏定芽和不定芽诱导的影响，建立了一个稳定的银杏茎段组培快繁体系，为通过组织培养快速繁殖银杏苗木提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料来源

以28号银杏成熟胚培养出的一个月月龄无菌幼苗各部位茎段为外植体。选择长势和高度基本一致的幼苗，按部位剪成3段：带有顶芽的上段0.5 cm左右，带腋芽的中段1 cm左右、带有子叶腋芽的下段1 cm左右，分别接种在下述不同的培养基上。

1.2 芽诱导培养基

以MS、DCR、N6、改良MS（NHNO减半）4种基本培养基。附加NAA0.1 ~ 0.5 mg/L、6-BA0.1 ~ 2.0 mg/L、AC（活性炭）0.25%。

1.3 培养基配制、灭菌及培养室条件

以上培养基各添加蔗糖30 g/L、琼脂7.0 g/L，pH值5.80左右；121℃高压灭菌20 min，每30 d继代1次。培养温度为25±2℃，光强为30 ~ 40 mol·m·s，每天14 h光照，10 h黑暗。

1.4 芽苗高度和基部愈伤组织直径测定

在培养的同时，观察各种培养基上外植体的生长状况，到一定培养时间后，均匀取出6棵，量取芽苗高度和基部愈伤组织直径。用SPSS11.5统计软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同调节剂浓度、不同培养基对顶芽生长的影响

将无菌苗的顶芽接种在四种基本培养基、附加不同浓度NAA、6-BA的培养基上（表1），培养30 d后发现，在MS培养基中不加调节剂的顶芽基部无愈伤组织的产生，顶芽只长高，展叶。附加调节剂后顶芽高度生长受到抑制，在NAA为0.1 mg/L时，随着6-BA浓度的提高，其抑制作用越强，2.0 mg/L时，顶芽高度只有对照的60.5%（4号培养基），6-BA的作用大于NAA；NAA为0.5 mg/L时，其与6-BA的联合作用加强，抑制作用加大；6-BA为2.0 mg/L时，顶芽高度只有对照的52%（7号培养基）。方差分析表明：各处理之间的高度达极显著的水平（F= 3.53 < F = 10.901）。多重对比表明，对照与各处理之间达极显著水平，而在2 ~ 5号培养基之间无显著性差异，6 ~ 7号培养基之间无显著性差异，但它们与2 ~ 5号培养基之间有显著性差异。

表1 不同NAA、6-BA浓度对顶芽生长的影响（30 d）

在DCR培养基上，0.5 mg/L的6-BA促进顶芽的生长，高浓度（1.0 ~ 2.0 mg/L）的6-BA抑制顶芽的生长，但抑制作用并没达到显著水平。与MS培养基比较，DCR培养基更有利于顶芽的高生长。

在N6、改良MS培养基上的顶芽高度较在MS和DCR培养基上的增加1 cm之多（如13号与9号），达极显著水平，其长势也是较粗壮，因此这两种培养基更有利于顶芽的培养，缺点是基部与愈伤组织直径较大。在各培养基上只发现顶芽的生长，未见不定芽的分化。

2.2 不同调节剂浓度、不同培养基对中段腋芽诱导和不定芽诱导的影响

剪取一个月月龄无菌苗的中段1 cm左右（带腋芽），接种在不同的培养基上培养30 d后，腋芽长出。在不加调节剂的MS和DCR培养基上一般都能诱导出一个腋芽，但茎段基部易木质化。在NAA0.1 ~ 0.5 mg/L，6-BA浓度小于2.0 mg/L时，除了诱导出腋芽外，还能诱导出不定芽（如2、3、6、9、12、13号培养基），6-BA浓度在2.0 mg/L时，茎段及腋芽会全部愈伤化。综合各指标，NAA0.1mg/L、6-BA0.5 mg/L 对腋芽诱导最好（表2）。

表2 不同NAA、6-BA浓度对中段腋芽诱导的影响

4种基本培养基（MS、DCR、N6、改良MS）中在NAA0.1 mg/L、6-BA0.5 mg/L和AC 0.25%时，对腋芽和不定芽的诱导无明显差异。整体来看N6培养基的诱导效果最好，其总正常芽诱导数和平均每个外植体芽诱导的芽数最多。但是也有缺点，表现在其基部的愈伤组织直径最大。

2.3 下段子叶腋芽的诱导

银杏的胚中有的带有两片子叶，有的带有3片子叶，培养成无菌苗后，会在子叶叶腋处留有2 ~ 3个子叶腋芽。一个月月龄的银杏无菌苗，剪去根部、顶芽、中段后，将带有子叶的下段1 cm左右，在不同培养基培养后，其子叶腋芽萌动和生长情况出现不同（表3）。

表3 不同NAA、6-BA浓度对子叶腋芽诱导的影响

从表3中可以看出，子叶的两个腋芽在不加调节剂的MS和DCR培养基上一般只有一个子叶腋芽长出，另一个不能萌动。添加NAA、6-BA后，在MS培养基上，NAA为0.1mg/L条件下，两个腋芽萌动的百分数多于只有一个腋芽的百分数，最高达50%，而在NAA为0.5 mg/L的条件下，则前者所占的百分率小于后者（7号除外），说明NAA对子叶腋芽的萌发作用大于6-BA，同时也说明外植体的位置效应明显，影响着其腋芽的萌动率。带有子叶下段的培养不但能把子叶腋芽诱导出来，还能诱导出不定芽，在6-BA0.5 ~ 1.0 mg/L的培养基上，都能诱导出新的不定芽，但在2.0 mg/L时出现愈伤化。总体效果仍然是N6与改良MS效果好，两者腋芽的诱导率最高达85%。

3 结论与讨论

将银杏不同部位的茎段分别培养后，其生长和分化存在位置效应，即带有顶芽的上段、带有腋芽的中段、带有子叶的下段，在培养过程中器官发生存在较大差异：顶芽段（上段）一般只长高，展叶；中段先诱导出腋芽或不定芽，再长高；下段一般能诱导出2 ~ 3个子叶腋芽和不定芽。

顶芽外植体在不加调节剂的培养基上虽能够生长，但会出现木质化，在DCR＋NAA0.1 mg/L＋6-BA0.5 mg/L、N6＋NAA0.1 mg/L＋6-BA0.5 mg/L、改良MS＋NAA0.1 mg/L＋6-BA0.5 mg/L的培养基上顶芽生长最好，高度最高，最高达2.98 cm，未见有不定芽的分化出来。

中段外植体在四种基本培养基（MS、DCR、N6、改良MS）中在0.1mg/L NAA、6-BA0.5mg/L和0.25%AC时，都能诱导出腋芽和不定芽，4种培养基之间诱导率无明显差异，整体来看N6培养基的诱导效果最好，平均每个外植体可产生1.56个芽。

带有子叶下段外植体，在改良MS＋NAA0.1 mg/L＋6-BA0.5 mg/L和N6＋NAA0.1 mg/L＋6-BA0.5 mg/L培养基上腋芽的诱导率均达80%以上，并且在NAA0.1 mg/L和6-BA0.5 mg/L下，有不定芽的出现。

培养基的基本成分也影响着顶芽高的生长和腋芽、子叶腋芽的诱导率，四种培养基中以N6和改良MS培养基最好。

郝岗平在银杏幼嫩茎段快繁中发现，顶芽数量虽少于腋芽，但仍可看出不同培养基对顶芽生长成苗的影响不同。这可能是由于顶芽和腋芽的生长模式、生理状态等不同造成的。我们的研究也表明顶芽在培养过程中只长高，未见不定芽的分化。带腋芽的茎段除了能把原有的腋芽诱导出来，还发现有不定芽的产生；另外带有子叶的下段，能够把2个或3个子叶腋芽诱导出来，除此之外还有新的不定芽诱导出来。

组织培养过程中的离体再生很大一部分在于生长素和细胞分裂素的比例，一般生长素/细胞分裂素比值高，有利于根的诱导，比值低有利于芽的诱导，而比值中等有利于愈伤组织的诱导。从我们的研究结果中可看出，银杏各部位在离体培养中的位置效应可能与其内源激素的含量有关。银杏的顶芽是生长素的主要存在部位，因而在离体培养时顶芽主要是高的生长，很难分化，添加6-BA后，改变了两者的比例，也改变了顶芽需要高生长素的要求，因而表现出抑制高的生长。

而在中段、下段内源激素可能主要以细胞分裂素存在，因而在不加调节剂的培养基上，腋芽也能萌发，添加低浓度的NAA和6-BA后，诱导的腋芽更加粗壮，同时能又诱导出不定芽来，这时NAA的诱导作用大于6-BA，体现外植体中生长素较低。

因此在银杏的茎段培养过程中，可以通过顶芽的不断伸长，获得遗传稳定性强的再生植株，这对保持银杏雌雄植株的性别和优良性状是有利的。通过对下部和带腋芽茎段的培养，可以获得不定芽，增加再生频率，达到快繁的目的。

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Studies of Stem Segments Culture in-vitro of

CHEN Ying，CAO Fu-liang，XU Cai-ping，WANG Gui-bin，ZHANG Wang-xiang

（）

Experiment was conducted by taking stem segments including terminal buds, segment with axillary buds, segments with cotyledon of 1-month seedling as explants for studying germination and differentiation of adventitious buds of. The result demonstrated that growth of terminal bud segments (upper section) was better in the medium of modified MS, N6, DCR supplemented with 0.1 mg/L NAA and 0.5 mg/L 6-BA than in other media, the highest shoot was up to 2.98 cm. But the adventitious buds were not observed. The explants of segments with axillary buds could induce axillary buds and adventitious buds in four media (MS, DCR, N6, modified MS) supplemented with 0.1 mg/L NAA and 0.5 mg/L 6-BA and 0.25%AC, and the induction rate had no significant difference among the four media, but N6 had better effect with 1.56 bud per explant. Segments with cotyledons could be induced with 2 ~ 3 axillary buds and adventitious buds. The two axillary buds induction rate was more than 80% in the media of modified MS＋0.1 mg/L NAA＋0.5 mg/L 6-BA and N6＋0.1 mg/L NAA＋0.5 mg/L 6-BA. The results indicated that different stem segments ofhad different induction effect.

stem of; tissue culture; position effect

1001-3776（2010）01-0028-04

S792.95

A

2009-10-25；

2009-12-14

江苏省高校自然科学研究计划项目（07KJB220048）

陈颖（1966－），女，山东潍坊人，副教授，博士，从事植物生物技术研究。