张少华， 曹福元， 张永杰， 田 青， 王建枝

(华中科技大学同济医学院病理生理学系，湖北 武汉 430030)

周围神经损伤是一类常见的神经系统疾病，如:三叉神经痛、臂丛神经痛、坐骨神经痛、视神经炎、面神经炎、面肌痉挛等，多由维生素缺乏、感染、外伤、中毒、压迫、缺血和代谢障碍等原因引起，轴突变性和节段性脱髓鞘是其主要的特征性病理改变。损伤后常伴有所支配效应器功能异常，如:骨骼肌运动障碍、顽固性疼痛等。由于上述特点，周围神经损伤给患者带来极大痛苦，探索积极有效的治疗方法是国内外学者关注的热点。睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)是一种能促进多种神经元存活和分化、保护神经元免受损伤并阻止神经元退行性变的神经活性蛋白［1］。研究发现CNTF能促进运动神经轴突再生［2－4］，但缺乏对受损神经功能恢复的直接评价。故本实验以大鼠坐骨神经损伤为模型，在损伤部位肌肉内注射CNTF，观察CNTF对大鼠坐骨神经再生长影响，并与神经生长因子(nerve growth factor，NGF)的作用进行对比研究，从神经功能的恢复方面评价CNTF对神经再生的促进作用。

材料和方法

1 动物与分组

雄性Wistar大鼠(同济医科大学实验动物中心提供)共60只，体重(250±20)g。随机将动物分成正常对照组、模型组、CNTF 给药小剂量组(48 μg/kg)、中剂量组(216 μg/kg)、大剂量组(1080 μg/kg)、NGF 给药组(20 μg/kg)，每组各 10只。建立模型，Wistar大鼠用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔内注射麻醉，备皮，消毒，于左后肢沿坐骨神经走向正中部切开皮肤，钝性分离显露坐骨神经，在梨状肌下缘8－10 mm处。先在10倍手术显微镜下以9－0无创缝线将神经鞘膜缝第1针，再完全切断生骨神经;又缝第2针，将两断端缝合好。逐层将肌肉及皮肤缝合，并进行消炎处理。4个给药组在损伤处分别肌注小剂量 CNTF(48 μg/kg)、中剂量 CNTF(216 μg/kg)。大剂量CNTF(1080 μg/kg)和 NGF(20 μg/kg)。模型组肌注等容量生理盐水，连续给药7 d后，每2 d给药1次至45 d。

2 电生理实验

将各组动物用药45 d后分别进行检测神经动作电位的潜伏期和传导速度。在神经损伤处切开皮肤沿神经走行钝性分离坐骨神经，用成都仪器厂生产的RM6240多导生理信号采集处理系统的生物电输入针形电极负端(蓝)插入左下腿皮下，电极正端(红)插入切开口中间的肌肉下，电极地线(黑)与一针灸银电极相连插入右腿。剌激电缆正端(红)与一针灸银电极相连，钩住神经损伤处的上端，负端(黑)与一针灸银电极相连插在鼠尾上，检测出神经动作电位的潜伏期，其参数设定为剌激强度0.2 V、波宽0.2 ms、延时5 ms、滤波1 kHZ，将分离出的神经放入神经盒中连接RM6240仪器测定传导速度［5］。

3 统计学处理

结 果

1 潜伏期

由图1可知，模型组的神经动作电位潜伏期比正常对照组显著增长(P＜0.01);与模型组相比较，CNTF各给药组和NGF给药组的潜伏期显著缩短(P＜0.01);同时，CNTF 216 μg/kg和1080 μg/kg 的潜伏期显著短于 CNTF 48 μg/kg 组(P ＜0.05);但是，CNTF 216 μg/kg 和 1080 μg/kg 组的潜伏期与NGF给药组之间无显著差别(P＞0.05)。

Figure 1.The effect of intramuscular injection of CNTF and NGF for 45 d on the latent period of action potential in all groups..n=10.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs model group;△P ＜0.05 vs 48 μg/kg CNTF.图1 术后45 d肌肉注射CNTF及NGF对各组神经动作电位潜伏期的影响

Figure 2.The effect of intramuscular injection of CNTF and NGF for 45 d on the conduction velocity of action potential..n=10.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs model group;△P ＜0.05 vs 48 μg/kg CNTF;▲▲P ＜0.01 vs 20 μg/kg NGF.图2 术后45 d肌肉注射CNTF及NGF对各组神经动作电位传导速度的影响

2 传导速度

由图2可知，与正常对照组相比，模型组的传导速度显著降低(P ＜0.01);CNTF 216 μg/kg和1080 μg/kg组的传导速度比模型组、NGF给药组显著增快(P＜0.01)，比CNTF 48 μg/kg组也显著增快(P＜0.05);CNTF 216 μg/kg和1080 μg/kg组的传导速度无显著差异(P＞0.05);CNTF 48 μg/kg组和NGF给药组的传导速度比模型组有增快的趋势，但差异不显著(P＞0.05)。

讨 论

CNTF是由200个氨基酸组成的酸性蛋白，分子量22－24 kD，因由对睫状神经元生长具有强烈作用而命名。睫状神经生长因子是神经营养因子家族成员之一，在功能上与NGF和脑源性生长因子(brain driver growth factor，BDNF)有交叉性。但在发育过程中的表达却与NGF和BDNF有所不同。

研究表明CNTF在中枢和周围神经系统中的雪旺细胞和星形胶质细胞浆中表达，对包括运动神经在内的神经细胞有广泛的作用［6］。Siegel等［7］在缺乏CNTF基因的小鼠中发现，无论是切断神经使肌肉失神经支配或是其它原因导致肌肉瘫痪，都不能发现神经芽生。而当给予外源性CNTF后，则可发现较多的不典型的芽生反应。因此认为CNTF是神经芽生过程中一个非常重要的因素。Cui等［8］发现CNTF可以促进视网膜神经节细胞轴突长入周围神经移植物。Newman等［9］发现CNTF能增加再生轴突末端的数量，增强再生轴突髓鞘的重新形成，说明CNTF可能对周围神经和骨骼肌同样有效。在神经损伤时，CNTF大量释放从而起到对神经的保护作用。研究发现CNTF在切割伤后的神经远侧端发生退行性变化的神经组织中仍可表达，呈向上调节趋势;通过神经趋化因子的表达，为神经再生与功能修复提供合适的微环境［10］。同时CNTF通过抑制caspase－3的表达，防止受损运动神经元的凋亡［11］。

本实验通过在坐骨神经损伤处直接肌注不同剂量的CNTF和NGF，测定神经动作电位潜伏期和传导速度。结果发现:与模型组相比较，CNTF各给药组神经动作电位潜伏期显著缩短(P＜0.01)，传导速度显著增快(P＜0.01);同时，中剂量、大剂量CNTF给药组和NGF给药组对神经动作电位潜伏期的影响无显著差别(P＞0.05)，但是中剂量、大剂量CNTF给药组的神经动作电位传导速度比NGF组显著增快(P＜0.01)。这说明CNTF对大鼠坐骨神经再生和功能的恢复具有促进作用，而且中剂量、大剂量 CNTF的作用优于NGF。所以，如果在治疗周围神经损伤病例中，通过局部诱导CNTF表达增强或外源性添加CNTF，可为神经再生和功能恢复创造良好的条件。

［1］Rezende LF，Stoppiglia LF，Souza KL，et al.Ciliary neurotrophic factor promotes survival of neonatal rat islets via the BCL － 2 anti－ apoptotic pathway［J］.J Endocrinol，2007，195(1):157 －165.

［2］Leibinger M，Müller A，Andreadaki A，et al.Neuroprotective and axon growth－promoting effects following inflammatory stimulation on mature retinal ganglion cells in mice depend on ciliary neurotrophic factor and leukemia inhibitory factor［J］.J Neurosci，2009，29(45):14334 －14341.

［3］Müller A，Hauk TG，Leibinger M，et al.ExogenousCNTF stimulates axon regeneration of retinal ganglion cells partially via endogenous CNTF［J］.Mol Cell Neurosci，2009，41(2):233 －246.

［4］Chen J，Chu YF，Chen JM，et al.Synergistic effects of NGF，CNTF and GDNF on functional recovery following sciatic nerve injury in rats［J］.Adv Med Sci，2010，55(1):32－42.

［5］陆 源，夏 强 主编.生理科学实验教程［M］.第1版.浙江大学出版社，2004.211 －214.

［6］Sleeman MW，Anderson KD.The ciliary neurotrophic factor and is receptor，CNTFR alpha［J］.Pharm Acta Helv，2000，74(2－3):265－272.

［7］Siegel SG，Patton B，English AW.Ciliary neurotrophic factor is required for motoneuron sprouting［J］.Exp Neurol，2000，166(2):205 －212.

［8］Cui Q，Harvey AR.CNTF promotes the regrowth of retinal ganglion cell axons into murine peripheral nerve grafts［J］.Neuroreport，2000，11(18):3999 －4002.

［9］Newman JP，Verity AN，Hawatmeh S，et al.Ciliary neurotrophic factor enhances peripheral nerve regeneration［J］.Arch Otolyaryngol Head Neck Surg，1996，122(4):399－403.

［10］顾晓松，严志强，范 明，等.CNTF和NGF在损伤后变性神经组织中的表达与分布［J］.中华显微外科杂志，1998，21(2):121 －123.

［11］张 谦，耿喜林，刘京升.CNTF抑制外周神经损伤后运动神经元的凋亡［J］.甘肃科技，2004，20(5):118 －119.