肖 瑛， 方开云， 石明隽， 刘瑞霞， 桂华珍， 郭 兵， 张国忠

(贵阳医学院病理生理学教研室，贵州 贵阳 550004)

有研究表明［1，2］，高糖状态和糖尿病肾病时肾小管上皮细胞表达骨形态发生蛋白－7(bone morphogenetic protein－7，BMP－7)减少，给予外源性 BMP－7或转基因过表达BMP－7可改善肾小管间质纤维化，逆转肾小管上皮细胞向间充质细胞转化，减少肾小管上皮细胞的丢失，促进肾小管上皮细胞功能的恢复。但高糖通过何种途径下调肾小管上皮细胞表达BMP－7尚未见明确的报道。本课题组动物实验研究提示［3］，高糖环境可激活p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)并且p38MAPK可能介导了糖尿病时BMP－7表达的下调，促进肌成纤维细胞活化，引起细胞外基质的大量沉积。为进一步证实p38MAPK是否确实参与高糖下调BMP－7的机制，我们进行了以下研究。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 雄性SD大鼠，重30－40 g，由贵阳医学院实验动物中心提供。

1.2 主要试剂 链脲佐菌素(STZ，Sigma)，山羊抗大鼠BMP－7多克隆抗体、羊抗大鼠p38MAPK、pp38MAPK多克隆抗体、驴抗山羊 －HRP(Santa Cruz)，兔抗大鼠纤维连接蛋白(fibronectin，FN)多克隆抗体、抗CK18抗体、抗α－SMA抗体(武汉博士德公司)，UltraSensitiveTMSP超敏试剂盒(羊)(福州迈新生物技术开发有限公司，KIT－9709/9719)，培养细胞 RNA提取试剂盒、Taq PCR MasterMix、DNA MarkerⅠ(北京TIANGEN生物技术有限公司)，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas);p38MAPK特异性阻断剂SB202190(Calbiochem);低糖DMEM(HyClone);胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco Introvagen)，D －glucose、D －mannitol(BBI)。

2 方法

2.1 大鼠原代肾小管上皮细胞的培养和鉴定 SD大鼠乙醚麻醉后无菌操作取出肾脏，去掉包膜和髓质，留下皮质剪碎后于80目筛网研磨，100目收集沉淀入离心管内，0.25%胰蛋白酶37℃消化30 min，1500 r/min离心10 min，含10%胎牛血清的DMEM终止消化，经台盼蓝计数后以2×105细胞接种于培养瓶，置37℃、5%CO2培养箱中培养。……