王晓雯 ，彭 宁 ，张 鹏 ，左 燕 ，张亚军 ，赵新锋

(1.陕西省人民医院药剂科，陕西 西安 710068; 2.西北大学生命科学学院，陕西 西安 710069)

红花为菊科一年生草本植物红花 Carthamus tinctorius L.的干燥花，具有活血通经、散瘀止痛的功效[1]。药理研究表明，黄酮类和色素类成分为红花扩张血管、增加冠脉流量和改善心脑血液循环的主要有效成分[2]。赵明波等[3]以羟基红花黄色素A为基准物，对不同产地的红花药材进行了指纹图谱分析。但除了基准物，上述研究未能对色谱峰进行归属，其原因在于缺少红花药材有效成分群的定性分析方法。笔者采用高效液相色谱-二极管阵列-离子阱质谱(HPLC-DAD-MSn)法对红花水提物中的黄酮类成分进行了定性分析，旨在为红花指纹图谱研究中色谱峰的归属提供参考，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1100系列高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，包括在线真空脱气机、二元梯度泵、柱温箱、二极管阵列检测器;SL型离子阱质谱(美国安捷伦公司);Maxima超纯水机(美国基因公司);Sartorius BP221S型万分之一电子天平(美国Sartorius公司)。红花药材(新疆产，经陕西省食品药品检验所鉴定);槲皮素化学对照品(中国药品生物制品检定所，批号为100081-200406);羟基红花黄色素A化学对照品(中国药品生物制品检定所，批号为11637-200503);色谱纯乙腈(Fisher公司，美国)，超纯蒸馏水(自制)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent SB-C18柱(150 mm ×2.1 mm，5 μm);流速:0.2 mL/min;柱温:30℃;检测波长:0～10.0 min为280 nm，10.0～25.0 min为 370 nm，25.0～45.0 min为 430 nm;流动相:A为0.2%的甲酸水溶液，B为甲醇，梯度洗脱，0～20.0 min为30%B，20.0～30.0 min为 30%B→65%B，30.0～45.0 min为 65%B。在此条件下，红花水提物的高效液相色谱图见图1。

图1 红花水提物高效液相色谱图

2.2 质谱条件

电喷雾负离子模式(ESI-)电离，雾化气压强为275 kPa，干燥气流速为7.0 mL/min，干燥气温度为325℃，毛细管电压为-4200 V，扫描范围为50～1500 amu。在此条件下，红花水提物的ESI-MS总离子流图见图2。

图2 红花水提物总离子流图

2.3 溶液制备

分别精密称取槲皮素和羟基红花黄色素A对照品0.012 g和0.016 g，以30.0%的甲醇水溶液溶解，分别置2个25.0 mL具塞量瓶中，加甲醇至刻度，制备成质量浓度分别为0.48 g/L和0.64 g/L的对照品溶液，4℃冷藏备用。取干燥至恒重的红花药材10.0 g，置250 mL圆底烧瓶中，加10倍量水，加热回流1.5 h，重复3次，抽滤，合并滤液，减压浓缩至膏状物，真空干燥，研磨成粉，以30.0%的甲醇水溶液定容于500.0 mL具塞量瓶中，即红花药材供试品溶液。4℃冷藏备用。

2.4 方法学考察

线性关系考察:分别精密吸取2.3项下槲皮素和羟基红花黄色素A对照品溶液适量，用30.0%的甲醇水溶液稀释为系列对照品溶液。在拟订的分析条件下，分别进样10.0 μL，对离子阱质谱的多级反应模式(MRM)进行分析。槲皮素选择 m/z 301.1→m/z 283.0为离子对，羟基红花黄色素A选择 m/z 611.2→m/z 449.1为离子对，测定提取离子流图的峰面积。分别以槲皮素和羟基红花黄色素A提取离子流图的峰面积对其质量浓度进行线性回归，得回归方程分别为 Y=12.4 X+1.2(r=0.9998)和 Y=5.1 X+0.4(r=0.9997)，质量浓度线性范围分别为0.48～48.0 μg/mL和0.64～320 μg/mL。

精密度试验:按2.3项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，用30%甲醇水溶液稀释10倍后，连续进样5次，每次10.0 μL，在拟订的分析条件下，分别测定槲皮素和羟基红花黄色素A的提取离子流图的峰面积，计算得其标准偏差 RSD分别为1.2%和0.87%。

稳定性试验:按2.3项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，以30%甲醇水溶液稀释10倍后，每2 h进样1次，每次10.0 μL，在拟订的分析条件下测定峰面积。结果48 h内槲皮素和羟基红花黄色素A峰面积的 RSD分别为1.3%和1.0%，表明供试品溶液在48 h内具有良好的稳定性。

重复性试验:按2.3项下供试品溶液制备方法制备5份供试品溶液，以30%甲醇水溶液稀释10倍后，分别进样，每份每次10.0 μL，在拟订的分析条件下测定峰面积。结果槲皮素和羟基红花黄色素A峰面积的 RSD分别为1.1%和1.2%。

回收率试验:取适量已知槲皮素和羟基红花黄色素A含量的红花药材5份，精密加入2.3项下槲皮素和羟基红花黄色素A对照品溶液适量后，按2.3项下方法制备成供试品溶液。以30%甲醇水溶液稀释10倍后，在拟订的分析条件下分别进样10.0 μL，测定峰面积，计算回收率。结果槲皮素和羟基红花黄色素A的平均回收率分别为98.7%和99.2%。

2.5 样品含量测定

按2.3项下供试品溶液制备方法制备红花供试品溶液5份，以30%甲醇水溶液稀释10倍后，在拟订的分析条件下进样，外标法计算含量。结果红花药材中槲皮素和羟基红花黄色素A的平均含量分别为0.13%和1.14%。

2.6 有效成分群定性分析

取2.3项下制备的供试品溶液，以30%甲醇水溶液稀释10倍后，在拟订的分析条件下进样10.0 μL。通过二极管阵列全扫描技术，按拟订的色谱条件设定单通道多波长，获得药材供试品溶液的紫外色谱图。比较紫外色谱图和全扫描总离子流图，二者基本对应。然而，紫外色谱图中有个别吸收很大的峰，在相应的总离子流图中强度却较弱，提示这些化合物在拟订的质谱条件下很难被离子化;此外，总离子流图上有许多强度较大的峰，在相应的紫外色谱图上却没有明显的吸收，推测红花药材中含有大量的紫外吸收弱、易离子化的化合物。在获得药材供试品溶液全扫描总离子流图的基础上，利用离子阱质谱的步进式碰撞技术，通过改变电场梯度和能量梯度，获得总离子流图中各峰的多级碎片信息，通过对照并结合相关文献[4-5]对各峰进行归属(见表1)，定性分析了19种化学成分，其中1种为未知化学成分。

表1 红花水提物电喷雾质谱解析表

3 讨论

总结红花中查耳酮类化合物在负离子模式下的裂解特征，发现该类化合物的结构中糖与苷元以C—苷键形式连接，通常情况下C—苷键较难发生断裂。因此，在负离子模式下，[M-H]-离子主要发生3'位或4'位取代基上的消除反应，以延长苷元结构中的共轭体系，如常可见丢失中性片断(相对分子质量为120)后所得基峰碎片离子。而对于多数糖苷类(包括黄酮苷类)化合物，在负离子模式下，主要发生糖苷键断裂，产生丢失糖片断后所得的碎片离子。该特性可用于区分醌型查耳酮类化合物与黄酮类化合物。

通过HPLC-ESI-MSn分析，对红花水提物中19种化学成分进行质谱解析，在确定18种化学成分的基础上，初步发现了1种未知的化学成分，对这种化学成分结构的定性还需进一步的研究。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社，2005:103-104.

[2]康 丽，颜晓燕，辛志伟.红花的药理作用研究进展[J].西南军医，2008，10(6):136-138.

[3]赵明波，邓秀兰，王亚玲，等.红花RP-HPLC指纹图谱的建立及其质量研究[J]. 药学学报，2004，39(3):212-216.

[4]姜建双，夏鹏飞，冯子明，等.红花化学成分研究[J].中国中药杂志，2008，33(24):2911-2913.

[5]周玉枝，陈 欢，乔 莉，等.红花化学成分研究[J].中国药物化学杂志，2007，17(6):380-382.