朱 卉， 朱丹妮， 余伯阳

(中国药科大学中药复方教研室，江苏南京211198)

消癌平注射液是由萝藦科(Asclepiadaceae)牛奶菜属植物通关藤(Marsdenia tenacissima(Roxb.)Wight et Arn.)的干燥藤茎经现代化工艺水提醇沉后制成，临床用于治疗原发性肝癌、食管癌和胃癌等恶性肿瘤，效果显著［1］。肿瘤的发生与多种因素有关，自由基是其中重要的因素，自由基参与人体的癌变过程。氧自由基所导致的细胞损伤刺激肿瘤的发生［2］。研究还发现许多肿瘤病人的癌细胞中氧自由基清除系统存在障碍［3］。消癌平注射液在临床上治疗多种肿瘤获得良好的疗效，但其抗肿瘤物质基础及作用机制目前仍不明确。

化学发光分析法(CL)具有灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单等优点，与高效液相色谱(HPLC)的高效分离特性相结合，成为一种有效的痕量分析技术。近年来，高效液相色谱-化学发光(HPLC-CL)联用技术发展迅速，已用于黄酮、合成除虫菊脂、多酚、儿茶酚胺、芳香族化合物等的检测［4-8］，还有文献报道用于检测药物在体内的分布、代谢情况［9-10］。

本试验将HPLC-CL联用技术用于消癌平注射液，在线检测其酚酸类物质清除两种氧自由基的活性，并利用HPLC-MS/MS分析技术鉴别其清除氧自由基的活性成分，为研究其抗肿瘤物质基础及作用机理提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1100型HPLC色谱仪(包括HP工作站、G1312A型二元泵、G1313A型全自动微量进样器、G1316A型柱温箱、G1314A型检测器);Agilent 1100 LC/MSD Trap XCT ESI质谱仪(Agilent Technologies，MA，USA)。

BPCL-1-G-C微弱发光测量仪及 BPCL Appl.7.2数据处理工作站(中国科学院北京生物物理研究所);十万分之一天平(梅特勒-托利多仪器有限公司，上海，AE-240);PHS-25型酸度计(上海雷磁仪器厂);BT-200恒流泵(沪西分析仪器厂，上海)。

1.2 试药

消癌平注射液(批号200903021，南京圣和药业提供)，绿原酸标准品(中国药品生物制品检定所，批号110753-200413)。

碳酸氢钠和无水碳酸钠(南京化学试剂厂，AR)，乙二胺四乙酸(EDTA)(上海化学试剂总厂，标准纯)，3-氨基邻苯二甲酰肼(鲁米诺，luminol)(Fluka公司)。过氧化氢(30%)(南京化学试剂厂，AR)，连苯三酚(遵义第二化学厂，AR)，乙腈(美国TEDIA公司，色谱级)，磷酸(南京化学试剂厂，AR)。

2 实验方法

2.1 供试品溶液的制备

消癌平注射液，取适量过0.45 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18分析柱(250 mm ×4.6 mm I.D.5 μm)(Dikma Technologies)。流动相:0.1%磷酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱:0～15 min(B为2%～4%)，15～20 min(B 为4% ～7%)，20～35 min(B为7% ～10%)，35～35.01(B 为10% ～11%)，35.01～50 min(B 为11% ～11%)，50～75 min(B为11% ～18%)，75～100 min(B 为18% ～25%)，100～105 min(B为25% ～2%)。流速1 mL/min，柱温30℃，检测波长300 nm。进样量:5 μL。

2.3 HPLC-MS/MS条件

HPLC分析条件:0.1%磷酸改用0.2%甲酸，其它条件同2.2项。

质谱分析条件:负离子检测模式;ESI离子源;扫描范围:m/z 100-1200。毛细管电压3500 V，干燥气流速9.0 L/min，温度350℃;雾化气压力40 psi。数据工作站为 LC/MSD Trap Software 4.2 and Data Analysis 2.2。

2.4 化学发光溶液的制备

碳酸缓冲液(pH 10.0 和11.0)0.1 mol/L 碳酸钠水溶液和0.1 mol/L碳酸氢钠水溶液按一定比例配成pH值为10.0和11.0缓冲液，分别加入 EDTA，使其浓度为6.3 ×10-3mol/L。

鲁米诺贮备液 精密称取一定量的鲁米诺，用0.1 mmol/L的碳酸钠水溶液配制成浓度为0.018 mol/L的鲁米诺贮备液，避光，4℃保存，3天后使用。

连苯三酚贮备液精密称取一定量的连苯三酚，用1mmol/L的盐酸水溶液配制成浓度为0.01 mol/L的连苯三酚贮备液，避光，4℃保存。

清除过氧化氢溶液的制备 试剂Ⅰ(鲁米诺溶液):精密量取鲁米诺贮备液用碳酸缓冲液(pH 10.0)稀释至浓度为 9.0 ×10-6mol/L。试剂Ⅱ(过氧化氢溶液):30%的过氧化氢溶液加水稀释至浓度为8.8 ×10-7mol/L。

清除超氧阴离子溶液的制备 试剂Ⅰ(鲁米诺溶液):精密量取鲁米诺贮备液用碳酸缓冲液(pH 11.0)稀释至浓度为 5.4×10-5mol/L。试剂Ⅱ(连苯三酚溶液):精密量取连苯三酚贮备液用水稀释至浓度为1.51×10-5mol/L。

2.5 检测装置示意图

HPLC-CL联用系统是由高效液相和化学发光两台仪器串联组成，主要包括HPLC(输液泵、色谱柱、DAD检测器)、混合器、化学发光检测器(流通池、光电倍增管和记录仪)及蠕动泵(输送化学发光溶液)等主要组成部分。两台仪器连接主要由不同内径PEEK管和T型管连接(见图1)。

3 结果与讨论

3.1 HPLC-CL条件的优化

吸收波长的选择:采用二极管阵列检测器(DAD)扫描，并结合文献报道［11］，最终选择300 nm为消癌平注射液的检测波长，此波长下各色谱峰分离较好，干扰较小。

流动相的考察:HPLC-CL在线联用方法，要求两种仪器检测条件及分析试剂的兼容性。相对于甲醇-醋酸、甲醇-磷酸、乙腈-醋酸洗脱系统，乙腈-磷酸洗脱系统具有较稳定的化学发光强度，磷酸浓度对化学发光的强度也有明显影响［4，12-13］。试验最终确定使用0.1%磷酸-乙腈为洗脱系统。

图1 HPLC-CL联用系统 P1-高压泵 P2-蠕动泵 C-电脑 D-化学发光仪 TM-T型管 W-废液 G-玻璃线圈Figure 1 HPLC-CL detection apparatus.P1-high pressure pump P2-peristaltic pump C-computer D-CL detector TM-mixing tee W-waste liquid G-glass coil.

化学发光溶液浓度和pH的确定:化学发光溶液的浓度和pH对于化学发光强度的稳定和样品活性成分的准确定量至关重要［4，14］，试验发现增加缓冲液的pH值和鲁米诺及连苯三酚的浓度能获得较高化学发光强度，但要使产生的自由基能被活性成分快速清除，达到灵敏的检测要求，必须有合适的试剂浓度和溶剂的pH值。结合本实验室的前期实验，对缓冲液的pH值和鲁米诺、过氧化氢、连苯三酚溶液的浓度分别进行考察，最终确定使用pH值为10.0的缓冲液和9.0×10-6mol/L鲁米诺及8.8×10-7mol/L过氧化氢溶液进行清除H2O2试验;使用pH值为11.0的缓冲液和5.4×10-5mol/L鲁米诺及1.51×10-5mol/L连苯三酚溶液进行清除O·-2自由基试验。

3.2 在线检测消癌平注射液清除H2O2及O·-2 自由基活性

样品中成分经色谱柱分离后，DAD检测器和CL检测器同步记录色谱信号和清除自由基信号。因此，通过HPLC-CL可以同时获得样品的HPLC色谱图和相应的活性图谱。由图2可见，消癌平注射液HPLC指纹图谱中1，2，3，4号峰信号较强，其清除H2O2能力也较强。在清除O2·-自由基方面，4号峰显示较强的活性，1，2，3号峰较弱。清除H2O2的检测信号强度明显高于O2·-自由基，这可能是因为H2O2和O2·-自由基本身氧化鲁米诺的能力不同，而且在这种检测方法中，H2O2是被直接检测的，是在检测过程中由反应产生的［4］。

3.3 HPLC-MS 分析

HPLC-MS/MS洗脱系统的确立:基于获得稳定的化学发光强度，3.1项中确定了0.1%磷酸和乙腈作为HPLC-CL的洗脱系统，而质谱检测中要求使用挥发性的酸试剂，因此本文根据与2.2项条件相同的洗脱梯度，通过改变0.1%磷酸为0.1%甲酸、0.2%甲酸、0.1% 醋酸、0.2% 醋酸，分别考察 HPLC色谱图的变化，结果显示使用0.2%甲酸，相应色谱图出峰数目和出峰顺序均未改变，对色谱图中活性物质的归属没有影响，如图3所示。最终采用0.2%甲酸-乙腈为HPLC-MS/MS洗脱系统。

图2 消癌平注射液紫外图谱(300 nm)及其清除H2O2和O·－自由基化学发光图谱。(A)紫外图谱、(B)清除2 H2O2图谱、(C)清除O2· -自由基图谱Figure 2 Chromatogram with UV at 300 nm detection and CL detection of Xiaoaiping based upon H2O2and O·－elimination.(A)UV detection.(B)CL detec-2 tion of Xiaoaiping based upon H2O2elimination.(C)CL detection of Xiaoaiping based upon O2·-elimination.

图3 流动相为0.2%甲酸时消癌平注射液色谱图Figure 3 Chromatogram of Xiaoaiping with the mobile phase of 0.2%formic acid

3种绿原酸类成分的鉴别:消癌平注射液中主要含酚酸类物质，已知的有绿原酸等。分析HPLCMS/MS谱图，发现色谱峰 1，2，3的［M-H］-离子m/z均为353。绿原酸有多种同分异构体，但具有不同的二级质谱特征［15-17］:3-咖啡酰奎尼酸二级质谱有m/z 191的基峰，m/z 179峰强度约为基峰强度的50%;5-咖啡酰奎尼酸二级质谱有m/z 191的基峰，m/z 179峰强度小于基峰强度的5%，4-咖啡酰奎尼酸二级质谱有m/z 173的基峰，同时有m/z 179、191峰。图5为3种物质的二级质谱图，根据标准品对照及二级质谱特征，推测1号峰为3-咖啡酰奎尼酸，2号峰为5-咖啡酰奎尼酸，3号峰为4-咖啡酰奎尼酸。

图4 消癌平注射液总离子流图Figure 4 Total ion chromatogram of Xiaoaiping

图5 绿原酸同分异构体的二级质谱图Figure 5 MS2spectra for isomeric caffeoylquinic acids

其他物质的分析:关于消癌平注射液中的化学成分，文献报道的仅有绿原酸、咖啡酸［18］。从通关藤药材中分离到的酚酸还有香草酸［19-20］。根据本实验的HPLC-MS/MS数据，推测4号峰为酚酸类物质，但其与咖啡酸、香草酸的质谱数据不匹配，由于文献报道有限，因此关于其成分的确证有待进一步研究。目前，关于通关藤抗癌物质基础的研究主要集中于其中的甾体类化合物，本文未检测到甾体类化合物，原因可能为:含量低于检测限;本文中HPLC流动相只能洗脱出极性较大的化合物，极性较小的甾体类可能未被洗脱。

4 结语

肿瘤发生与自由基密切相关，消癌平注射液中酚酸类物质清除自由基能力较强，提示清除自由基可能是消癌平注射液发挥抗肿瘤作用的一种途径。

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