高 飞,黄庆晖,黄越玲,孙卫文,戴丽军,沈岩松,李敏雄,陈盛强,刘忠民

癫痫是神经系统常见病之一,是由多 种病因引起的慢性脑性疾病,以大脑神经元突发性异常放电所致的突然、反复和短暂的大脑功能障碍为特征。近年来研究表明,癫痫病灶处的能量、氧及血流量有相应的变化,特别是缺氧和缺血后再灌注损伤,可产生大量的氧自由基,并形成自由基连锁反应。氧自由基能攻击多不饱和脂肪酸 (PUFA)引发脂质过氧化作用,生成大量的丙二醛 (MDA)及新的氧自由基等复杂产物,继而引起细胞代谢和功能障碍,参与癫痫对脑的损伤[1-2]。与此同时,一氧化氮 (NO)通过介导谷氨酸(GLU)从突触前膜释放后,GLU作用于突触后膜上的 GLU离子型受体——N-甲基 -D-天冬氨酸受体 (NMDAR),使Ca2+通道开放,Ca2+内流,从而参与了癫痫点燃的过程。柴胡桂枝汤出自 《伤寒论》,是小柴胡汤和桂枝汤的合方,由柴胡、桂枝、黄芩、半夏、芍药、生姜、大枣、甘草组成,属于治疗太阳和少阳并证的方剂,主要用于太阳少阳合并引起的发热微恶寒、肢节烦痛、微呕、心下支结等症。随着对柴胡桂枝汤研究的深入,大量文献报道,柴胡桂枝汤可通过增强 γ-氨基丁酸 (GABA)介导的抑制作用,来调节脑内兴奋性神经递质和抑制性神经递质含量的平衡[3-4],以降低癫痫发作次数;此外,柴胡桂枝汤具有稳定细胞膜结构,抑制自由基的产生,从而起到抗氧化及延缓衰老的作用。为进一步探讨柴胡桂枝汤的抗癫痫、抗氧化作用的机制,本实验拟用 Fmr1基因敲除小鼠作为模型,观察其用药前后行为学改变及脑组织超氧化物歧化酶 (SOD)活性和 MDA、NO水平的变化。

1 材料与方法

1.1 实验药物 柴胡桂枝汤挥发油,应用超临界二氧化碳 (CO2)萃取技术从柴胡桂枝汤中提取,萃取釜压力 20 MPa,温度 30℃;解折釜Ⅰ压力 12 MPa,温度60℃;解折釜Ⅱ压力 60 MPa,温度 40℃。

1.2 实验动物 Fmr1基因敲除型 (KO)纯合子 (-/-)及其野生型 (WT)纯合子 (+/+)FVB近交系小鼠,由荷兰伊拉斯塔斯大学细胞生物学及遗传学研究中心 Oostra BA教授惠赠,广州医学院实验动物中心饲养及繁殖。实验动物的操作及饲养均符合广东省及广州医学院实验动物管理饲养条例,遵循人道原则。

1.3 实验试剂与仪器 (1)试剂:SOD、MDA、NO测定试剂盒 (南京建成生物工程研究所);(2)仪器:Bio-rid酶标仪、低速离心机、旷场分析箱。旷场分析箱的制作:用一块黑色胶板做成一个边长为 72 cm的正方形,用胶纸作线条分成 16个边长为 18 cm的正方形,该板中心作一个边长为 18 cm的正方形,在该板边缘 2 cm处围成一个边长为 68 cm的正方形,从边缘到中心小正方形依次命名为第一区、第二区、第三区、第四区,第四区也叫中央区。再以该板为底面做成无盖长方体 (72 cm×72 cm×60 cm)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验动物的基因型鉴定

1.4.1.1 PCR扩增的引物合成 针对Fmr1基因敲除型和野生型 FVB纯系小鼠的基因型设计引物:引物 M2 5′-AGTCATGCTATGGATATCAG-3′和 N2 5′-TGGGCTCTATGGCTTCTGA-3′, 用于 检测基因敲除小鼠 Fmr1中包含新霉素插入片段的等位基因片段 (扩增产物的大小约为 800 bp)。引物 S1 5′-GTGGTTAGCTAAAGTGAGGATGAT-3′和 S2 5′-CAGGTTTGTTGGGATTAACAGATC-3′,用于检测野生型小鼠的 Fmr1等位基因的片段 (扩增产物的大小为 468 bp)。

1.4.1.2 DNA的提取和定量 (1)DNA的提取:取小鼠尾巴 1.5 cm装在1.5 ml离心管中并编号,加 500μl蛋白酶 K溶解尾巴,溶解后加 500μl Tris平衡酚用震荡机大力摇匀 30 s;离心 5 min(13 000 r/min);取上清液于另一离心管中并加 500μl氯仿异戊醇,用震荡机大力摇匀 30 s;离心 5 min(13 000 r/min);取上清液于另一离心管中,加 40μl 3 mol/LNaAC(pH 5.2),再加 1 ml无水乙醇,用手摇匀,可见絮状 DNA;离心 5 min(13 000 r/min);倒掉上清液保留离心管底部灰白色沉淀,加 1 ml 75%乙醇,用震荡机大力摇匀 30 s;离心 5 min(13 000 r/min);倒掉上清液,晾干,加380μl TE溶液,保存在温度为 55℃的温箱里 5 min。(2)DNA的定量:取 2.5μl洗脱液稀释 20倍后,加入比色杯,测定OD值。

1.4.1.3 PCR扩增 PCR反应总体积为30μl,含 DNA 100 ng、 TaqDNA聚合酶1.0 U、引物各 0.35μmol/L、dNTP 200 μmol/L、10×TaqBuffer 3 μl和双蒸水。PCR扩增条件为:热启动,94℃预变性 5 min,然后以下列温度和时间循环 30次:94℃30 s,65℃30 s,72℃1.5 min。末次循环后均于 72℃延伸 10 min,4℃保存。

1.4.1.4 1.5%琼脂糖凝胶电泳 分别取PCR扩增产物 8μl、10×Loading Buffer 1 μl在含 0.5 mg/L溴化乙锭的 1.5%琼脂糖凝胶中以 100 V电泳后于凝胶成像仪中观察拍照。

1.4.2 旷场实验方法

1.4.2.1 分组 健康的 FVB小鼠分为KO空白组、KO用药组;WT空白组、WT用药组共 4组,每组 15只,普通级,雌雄兼用,体质量 (15士 3)g,日龄为30 d。用药组腹腔注射柴胡桂枝汤挥发油(1.7 ml/kg)。空白组腹腔注射植物油,注射方式、剂量以及观察方法同用药组。

1.4.2.2 旷场实验 把制作好的旷场分析箱放在光线充足的地方,在底面放一块透明玻璃,在其正上方安装好摄像机,调整好录像画面;将出生 30 d的小鼠从旷场箱边缘放入,让其自由爬行,并记录下小鼠在旷场中 5 min的行为表现。为防止小鼠在旷场中留下异味,干扰实验结果,每实验完一只小鼠用 75%乙醇将透明玻璃擦洗一遍。旷场分析 viewer软件为德国BIOBSERVE公司产品。

1.4.3 脑组织的取材及脑组织匀浆的制作 给予做完旷场实验的小鼠 15 min的铃声刺激,然后断头处死小鼠,迅速在冰块上分别取出脑皮质、海马,准确称重,经预冷 0.9%氯化钠溶液漂洗去血液,滤纸吸干,制成 10%的组织匀浆,离心取上清作为待检测标本,用邻苯三酚自氧化法检测 SOD,TBA法测定 MDA,硝酸还原酶法测定 NO。

1.5 统计学方法 数据采用 SPSS 13.0统计分析软件处理,实验结果用 (x±s)表示,组间比较采用 t检验。

2 结果

2.1 实验动物模型检测

2.1.1 实验动物基因型鉴定 KO和 WT小鼠基因 PCR扩增结果如图 1所示。以M2和 N2为引物,经 PCR在 KO小鼠扩增出约 800 bp的 DNA片断;以 S1和 S2为引物,经 PCR在 WT小鼠扩增出约 468 bp的 DNA片断。KO小鼠由于在 Fmr1基因第5个外显子中插入了一个新霉素片断,而阻断了 468 bp DNA片断的扩增,证实脆性 X综合征小鼠模型 Fmr1基因缺陷。

2.1.2 Fmr1基因敲除小鼠行为学观察KO小鼠多动,易激惹,同窝小鼠之间常斗殴,易发癫痫;雄鼠睾丸较大,繁殖力差。

2.2 柴胡桂枝汤挥发油对 WT和 KO小鼠旷场行为学影响 KO空白组与 WT空白组相比,KO小鼠运动的平均速度、总路程及进入各个区的次数均比 WT空白组小鼠大,差异有统计学意义 (P＜0.05,见表 1)。无论是 WT小鼠还是 KO小鼠,用药组小鼠运动的平均速度、总路程及进入各区的次数均减少,与相应的空白组比较,差异有统计学意义 (P＜0.05,见表2、表 3)。

2.3 柴胡桂枝汤挥发油对 WT和 KO小鼠脑组织 SOD活力及 MDA和 NO水平的影响 WT用药组小鼠的 SOD活力、MDA和 NO水平与 WT空白组小鼠比较,差异均有统计学意义 (P＜0.05,见表4);KO用药组小鼠的 SOD活力、MDA和 NO水平与 KO空白组小鼠比较,差异亦均有统计学意义 (P＜0.05,见表 5)。

表 1 WT空白组与 KO空白组小鼠的行为学指标比较 (x±s)Table 1 The comparison of mice behavior indicators between KO control group and WT control group

表 2 WT空白组与WT用药组小鼠的行为学指标比较 (x±s)Table 2 The comparison of mice behavior indicators between WT control group and WT treatment group

表 3 KO空白组与KO用药组小鼠的行为学指标比较 (x±s)Table 3 The comparison of mice behavior indicators between KO control group and KO treatment group

表 4 柴胡桂枝汤挥发油对 WT小鼠脑组织SOD活力及 MDA和 NO水平的影响 (x±s)Table 4 Influenceof bupleuriand ramuli cinnamomi decoction on the level of malondialdehyde,nitrogen monoxidum and superoxide dismutase in WT mice

图 1 KO和 WT小鼠 Fmr1基因片断 PCR扩增结果 (1.5%琼脂糖凝胶电泳)Figur e 1 PCR analysis of DNA from a wild type mouse(lane 2),and a heterozygous female(lane 3),a mutant male(lane 4),a mutant female(lane 5).Primer S1 and S2 were used to detect the 468 bp fragment of the wild-type allele(lane4,5),and primer M2 and N2 wereused to detect the 800bp fragment of the konckout allele(lane 4,5).Lane 1 contains a size marker

表 5 柴胡桂枝汤挥发油对 KO小鼠脑组织SOD活力及 MDA和NO水平的影响 (x±s)Table 5 Influenceof bupleuriand ramuli cinnamomi decoction on the level of malondialdehyde,nitrogen monoxidum and superoxide dismutase in KO mice

3 讨论

遗传性智力低下是神经系统疾病中一类主要的疾病,脆性 X综合征 (fragile X syndrome)是最常见的遗传性智力低下性疾病之一,其发病率男性约为 1/1 250,女性为 1/2 500,占非特异性智力低下的2%～6%,在 X连锁智力低下中占 40%。由于 CCG重复序列扩增和继发启动子区域甲基化的 FMRI基因沉默,故患者缺少FMRI(fragile x gene)蛋白。Fmr1基因敲除鼠缺乏正常的 FMRI蛋白,表现巨睾症、记忆力缺失、行为异常和智力低下[5-6]。本研究采用了旷场分析的方法对30日龄的 Fmr1基因敲除小鼠的旷场行为进行观察。旷场分析能对动物对新异环境的兴奋性、适应性、探究、紧张、记忆等多种行为进行评价[7-8],为开展脑的发育及老化过程的研究提供了行为学实验的参考依据。

Fmr1基因敲除鼠缺乏正常的 FMRI蛋白,表现为多动,易激惹,同窝小鼠之间常斗殴,易发癫痫;雄鼠睾丸较大,繁殖力差。与此同时,由表 1结果可表明,KO空白组与 WT空白组相比,KO小鼠运动的平均速度、总路程及进入各个区的次数均比 WT空白组小鼠大,说明 KO小鼠的探索性、兴奋性、运动性均比 WT小鼠要高,这与文献报道相符。

NO是近年来生物学研究中备受关注的活性递质[9],NO寿命短,一经形成便可被液体中的氧灭活成 NO-2及 NO-3,故NO-2+NO-3可以准确代表体内 NO水平,本实验利用硝酸还原酶特异性地将 NO-3还原成 NO-2,然后用比色法测定 NO-2间接反映组织中 NO水平,该法灵敏、简便、稳定可靠。国内外文献报道,癫痫发作期 NO水平会增高,并且与癫痫发作的程度和时间成正比。癫痫发作时间越长,癫痫程度越高,NO水平越高。本实验证实,无论是 WT小鼠还是 KO小鼠,用药组较空白组脑组织中 NO水平显著降低。说明柴胡桂枝汤挥发油对 NO的生成有一定的抑制作用。

与此同时,用药组小鼠脑组织 MDA水平较空白组也显著降低。MDA脂质过氧化物与癫痫灶内痫样皮层电 (ECOG)活动的产生和发展有密切关系,具有很强的生物毒性。它是氧自由基攻击细胞膜的产物,能间接反映细胞损伤的程度。

SOD是机体清除 MDA的关键酶,其活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力。它特异性催化超氧阴离子自由基(O2-)发生歧化反应,再经过氧化氢酶(CAT)转化成 H2O和 O2,从而消除了O2-的毒性作用,减少癫痫的发生[10]。本实验中,用药后的 KO和 WT小鼠的 SOD活力均较空白组显著提高。由此可知,柴胡桂枝汤挥发油能有效清除自由基、阻止过氧化物生成,减少 NO的神经毒性,具有保护脑细胞的作用。

当然,引起神经元同步放电的因素是多方面的,目前单纯使用自由基清除剂治疗癫痫不能达到理想效果,尚需与抗癫痫药物联合应用。但通过本实验可以预见,进一步探索癫痫发生的自由基病理机制,开发有效清除自由基的药物具有广阔的前景,并将为人类最终战胜癫痫提供有力的帮助。

1 Frantseva MV,Perez Velazquez JL,Hwang PA,et al.Free radical production correlates with death-in an vitro model of epilepsy[J].Eur Neurosci,2000,12(4):1431-1439.

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3 龚素珍,廖卫平,郑德枢,等 .柴胡抗惊厥作用的实验研究 [J].广州医学院学报,1997,25(1):24-26.

4 刘燕,廖卫平,郭姣,等 .柴胡三种萃取物的抗惊厥作用研究比较 [J].中医药学报,2002,30(6):21-22.

5 Fu YH,kuhl DP,Pizzuti A,et al.Variation of the CCG repeat at the fragile X site results in genetic instability:resolution of the Sherman paradox[J].Cell,1991,67(6):1047-1058.

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9 孙长凯,黄远桂 .一氧化氮 (NO)研究:分子、细胞、免疫与神经科学 [J].中国神经免疫和神经病学杂志,1995,2(1):184.

10 Bellissimo MI,Amado D,Abdalla DS,et al.Superoxide dismutase,glutathione peroxidase activities and the hydroperoxide concentration are modified in the hippocampus of epileptic rats[J].Epilepsy Res,2001,46(2):121-128.