孔令斌,房玉海,丁守华,杨志寅,卜志强,刘 东,陈 鹏

2型糖尿病 (T2DM)是由遗传因素和环境因素共同作用导致的一类代谢异常综合征。WHO报告显示,1998年 DM居全球疾病死因顺位的第六位,疾病负担顺位第三位,近年来其发病率急剧升高,而且其发病年龄日趋年轻化,已成为世界各国日益关注的公共卫生问题[1]。因此研究 T2DM发生的危险因素,对于实施有针对性的预防干预措施,延缓或防止 T2DM及其并发症的发生、发展具有重要的临床意义[2-5]。T2DM的病因复杂,并非由单一因素所致,遗传、环境因素及不良生活方式和行为习惯在疾病的发生、发展过程中均起着非常重要的作用[6]。由于饮食模式影响机体的血糖、血脂的代谢,因此,采用各种有效的干预措施来降低血糖和血脂水平是目前许多国家 DM及心脑血管疾病防治工作的重点[7-8]。目前已有大量研究证实了以膳食干预为主的综合干预措施的有效性,然而,在临床上并不是每一位 T2DM患者经过膳食行为干预后都能够取得满意的效果,考虑可能与患者的遗传背景有关[9]。因此,有必要探讨基因多态性对 T2DM的发病及其治疗干预措施的影响,为制定更为个体化的膳食干预对策提供科学依据,减少治疗的盲目性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 于 2003年 9月—2005年 9月在山东省梁山县疾病预防控制中心糖尿病门诊随机抽取 378例自愿参加研究的新发 T2DM患者为研究对象,均符合 WHO 1999年糖尿病诊断标准[10]。检测其脂蛋白脂酶 (LPL)基因 S447多态性,根据基因型分为两组,一组为 LPL S/X+X/X基因型 (A组),另一组为 S/S基因型 (B组)。然后对两组患者只进行饮食干预,干预时间为 2年,随访结束后,共随访到依从性强的T2DM患者 342例,随访率为 90.48%,其中 A组 60例,B组282例,检测两组患者的空腹血糖 (FPG)、血脂等指标并进行比较。干预前两组患者的性别、年龄、血糖、血脂等指标间差别均无统计学意义 (P＞0.05,见表 1、2),具有可比性。

1.2 方法 取患者空腹肘静脉血5 ml,将其中 3 ml血液当日分离血清,采用全自动血液生化分析仪检测血糖、血脂;另外2 ml用 5%的 EDTA-Na2(1 ml血液加 20μl抗凝剂 ),用于基因组 DNA提取。(1)基因组 DNA抽提:低渗溶血法制备白细胞,苯酚氯仿抽提 DNA。(2)PCR扩增:以提取的 DNA为模板,利用设计的上、下游引物特异性扩增 LPL基因 S447位点的特异片段。引物序列为:上游引物 5′-TACACTAGCAATGTCTAGGTGA-3′;下 游 引 物 5′-TCAGCTTTAGCCCAGAATGC-3′。PCR反应总体积为 40μl,其中含 10×PCR Buffer 4μl,10 mmol dNTPs 0.8μl,上下游引物各8 pmol,Taq酶 3 U,膜板 3μl,加无菌去离子水至 40μl。取单份 PCR反应管,加入提取的基因组 DNA(或阳性质控品、阴性质控品)3μl,10 000 r/min瞬时离心 30 s。将各反应管做好标记,置入 PCR反应槽,按照下列条件扩增,循环条件:94℃变性 2 min,93℃退火 30 s,72℃延伸 30 s,共 35个循环,最后 72℃延伸 5 min。 (3)电泳检测:取 PCR扩增产物 10μl,加 2 μl 6×Loading Buffer,加样点样于琼脂糖凝胶孔中,以 5 V/cm电压,1×TAE中电泳,紫外灯下观察结果,凝胶成像分析系统下拍照。

1.3 统计学方法 应用 SPSS13.0软件进行统计学处理。计量资料用 (x±s)表示,采用 t检验,计数资料的比较采用 χ2检验,以 P＜0.05为差异有统计学意义。

表 1 干预前两组患者的性别和年龄比较 (例)Table 1 The comparison of enumeration indexes between A group and B group before dietary intervention

2 结果

2.1 S/X及 X/X基因型患者膳食行为干预前后各项观察指标的比较 LPLS/X及 X/X基因型患者在膳食行为干预后 FPG、腰臀围比值 (WHR)及三酰甘油 (TG)水平降低,而体质指数 (BMI)、血清高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C)水平升高,干预前后比较差别有统计学意义 (P＜0.01);血总胆固醇(TC)水平及收缩压 (SBP)在干预前后差别无统计学意义(P＞0.05,见表 3)。

2.2 S/S基因型患者膳食行为干预前后各项观察指标的比较LPL S/S基因型患者在膳食行为干预前后血脂水平及 BMI、WHR、SBP比较差别均无统计学意义 (P＞0.05),尽管干预前后 FPG水平差别有统计学意义 (P＜0.01),但 S/S基因型患者干预后 FPG平均水平仍处在非正常范围内 (见表 4)。

2.3 膳食行为干预后不同基因型患者各项指标的比较 干预后 A组患者的 FPG、TG、BMI及 WHR低于 B组患者,HDLC水平高于 B组患者,差别均有统计学意义 (P＜0.05,见表5)。

表 2 干预前两组患者的血糖和血脂等指标比较 (x±s)Table 2 The comparison of measurement indexes between A group and B group before dietary intervention

表 3 S/X及 X/X基因型患者膳食行为干预前后血糖和血脂等指标的比较 (x±s)Table 3 The comparison of indexes in patients with S/X and X/X genotype before and after intervention

表 4 S/S基因型患者膳食行为干预前后血糖和血脂等指标的比较 (x±s)Table 4 The comparison of indexes in patients with S/Sgenotype before and after intervention

表 5 膳食行为干预后两组患者的血糖和血脂等指标比较 (x±s)Table 5 The comparison of indexes between patientswith differert genotypes after intervention

3 讨论

LPL是水解脂蛋白中 TG的重要酶类,主要由脂肪细胞、心肌、骨骼肌等肝外实质细胞粗面内质网合成并分泌,释放入血后,借助硫酸肝素等葡糖胺聚糖结合在毛细血管内皮细胞上发挥其生理功能。活性形式为通过非共价键结合形成的同源二聚体,二聚体分离则脂解 TG的活性进行性丧失,其催化中心由 Ser132、Asp156、His241组成[11]。载脂蛋白 CⅡ (apoCⅡ)为 LPL的激活剂,载脂蛋白 CⅢ (apoCⅢ)则抑制其活性。LPL主要生理功能是水解血液中富含 TG脂蛋白中的三脂酰甘油,使其分解为甘油二酯和甘油一酯,释放游离脂肪酸以供组织氧化分解并为机体提供能量,是清除血液中乳糜微粒(CM)和极低密度脂蛋白 (VLDL)的限速酶。

LPL基因存在着多种变异方式,目前发现的多态性位点有Asp9Asn、Asn291Ser、Ser447Ter、PvuⅡ、HindⅢ、 BamHI、BstⅠ、BglⅡ、XbaⅠ等,LPL基因突变可导致其活性的变化,进而影响到其脂解功能。在以上基因位点突变中,目前大多数研究认为,PvuⅡ、HindⅢ多态性变化能够降低脂蛋白脂酶的活性,引起脂质代谢紊乱,而对于 LPL基因 S447X多态性则多数研究认为该基因突变是一种保护性变异,能够改善血脂谱。Nierman等[12]研究显示,LPLS447X携带者血液中含丰富三酰甘油的脂蛋白 (TRL)转化增快,LDL apoB100清除率增加,并且肝前血浆 LPL浓度增长了 4倍。关于该多态性对 TG和 HDL-C的影响,Lee等[13]通过对居住新加坡的华人、马来人及亚洲印第安人的研究显示,LPLS447X多态性在该研究人群中发生率很高,且 X447等位基因携带者血 TG水平较非基因突变者明显降低,而血浆 HDL-C水平则明显升高。同时该研究还发现,在女性 X447携带者中,血浆 LDL-C水平也明显下降。Thu等[14]对 351位越南 7～9岁女孩研究发现,与S447S基因型相比较,S447X多态性与血浆高 HDL-C水平相关 (7.4%,P=0.007),并且会导致血 TG水平降低(-13.6%,P=0.04)。Wittrup等[15]对丹麦正常人及心肌缺血者的研究显示,女性 S447X携带者杂合型和纯合型血浆 TG水平分别下降 0.11 mmol/L和 0.18 mmol/L(P=0.001和 P=0.37);HDL-C水平分别升高 0.07 mmol/L和 0.03 mmol/L(P=0.001和 P=0.99)。男性杂合型和纯合型携带者血浆 TG水平分别下降 0.20 mmol/L和 0.41 mmol/L(P＜0.001和 P=0.06);HDL-C水平分别升高 0.05 mmol/L和 0.17 mmol/L(P=0.02和 P=0.04)。但亦有对亚洲种族的研究认为 X447等位基因与 HDL-C水平之间关联不明显[16],甚至没有关联[17]。

本研究结果显示,LPL S/X及 X/X基因型患者在膳食行为干预后 FPG、TG等指标水平明显降低而血浆 HDL-C水平明显升高,干预前后有明显差别;S/S基因型患者在膳食行为干预后尽管血脂水平较干预前有所降低,但差别无显著性。对不同基因型患者膳食干预后各项指标进行比较发现,S/X及X/X基因型患者干预后 FPG、TG及 HDL-C等指标变化幅度显著大于 S/S基因型患者,表明 S/X及 X/X基因型的 T2DM患者对膳食干预更为敏感。进一步表明 LPLS447X基因型不仅影响正常人的血脂水平,而且影响 T2DM患者的血脂、血糖水平。提示临床医生在制定和实施膳食干预措施时,除考虑患者的年龄、性别、吸烟、饮酒等生活习惯外,还必须考虑患者自身的遗传背景,有针对性地开展饮食干预,以减少干预治疗的盲目性,提高 T2DM的治疗效果,减少不必要的人力、物力和财力资源的浪费。

LPLS447X多态性有益于患者血脂、血糖水平。虽然有研究认为其机制可能通过改变 LPL结构产生缺陷的 LPL分子;也可能通过增加或降低 mRNA转录,最终影响蛋白质水平;或通过其他潜在机制影响 LPL酶活性及 LPL的其他功能,包括催化功能、分泌功能、亚基间的聚合状态、与肝素及底物的结合能力等。对此,部分学者做出了如下推断,Nierman等[12]认为,可能与截断突变导致的 LPL二聚体脂解活性增高有关,或是由于 LPLS447X蛋白质在羧基末端缺少了两个氨基酸致使LPL-TRL结合更加牢固,调节并易化了酶对血脂的转化。也有研究认为 S447X突变可能增加了 LPL与脂蛋白及细胞表面受体的相互作用,或者增强了其酶活性以外的功能,如通过介导受体对脂蛋白摄取的桥梁作用增强从而加快了 TG的清除[18]。亦有研究认为突变通过增加或降低 mRNA转录,最终影响蛋白质水平。因此,S447X多态性究竟是通过哪一种途径使 LPL生物学功能发生改变尚需进一步研究。

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