陆佳伟,贾俊海,张 锋,韩 春

对于缺血再灌注损伤的保护作用,早在 1986年 Murry 等[1]就首次提出缺血预处理这种经典的器官保护方法,但由于预处理是在缺血前应用,而临床中的缺血往往是未知的,所以预处理的这种局限性使得其未能在临床上真正地推广和应用。2003年,Zhao等[2]又提出了缺血后处理 (ischemic postconditioning,IPC)的概念,但缺血后处理是在再灌注前即刻进行数次、短暂的缺血再灌注 (ischemia-reperfusion,I/R),其本质具有侵害性,于是近两年人们又考虑到一种新的缺血保护策略,即药物后处理 (pharmacological postconditioning)。药物后处理是缺血后处理研究的深入,是一种利用药物干预的缺血保护措施[3]。但目前仍有许多问题困扰着我们:是否有种属的差异、最佳后处理方式 (麻醉药浓度、持续时间)和时机 (开始干预和结束时间)的选择、远期结果的评估以及进一步明确其作用机制等。本实验将主要研究不同剂量维生素 C后处理对肾缺血再灌注损伤的影响及核因子 -κB亚基 p65亲和肽 (NF-κBp65)、一氧化氮 (NO)在肾缺血再灌注损伤中的相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 体质量 240～250 g的健康成年雄性 SD大鼠 30只(江苏大学实验动物中心提供)。超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛 (MDA)、血尿素氮 (BUN)、肌酐 (Cr)和 NO试剂盒(由南京建成生物工程研究所提供)。兔 NF-κBp65多克隆抗体、DAB显色试剂盒、即用型 SABC染色试剂盒 (由武汉博士德生物工程有限公司提供)。维生素 C注射液 (无锡市第七制药有限公司)。UV2754分光光度计 (上海第三分析仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组与模型制备 (1)实验分组:将 SD大鼠随机分为 5组,每组6只。①假手术组 (Sham组);②肾脏缺血再灌注处理组 (RIR组);③低剂量维生素 C后处理组 (LVc-PO组);④中剂量维生素 C后处理组 (MVcPO组);⑤高剂量维生素 C后处理组 (HVcPO组)。 (2)模型制备:实验动物术前禁食 12 h,自由进水。将大鼠用 30 g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,去毛、固定,沿上腹部正中线逐层切开,显露和游离肾脏,仔细分离肾蒂,保护输尿管。用无损伤动脉夹夹闭肾蒂,肾脏颜色变为暗红色可确认为肾脏血流阻断,造成肾缺血,而后松开动脉夹,肾脏由暗红色转为鲜红色可确认为血流恢复。Sham组:仅行开腹后游离双侧肾脏,动脉夹夹闭右侧肾蒂,0.9%氯化钠溶液纱布覆盖伤口,暴露 45 min后逐层缝合关腹,2 h后留取标本;RIR组:动脉夹夹闭双侧肾蒂,45 min后恢复血供,余同上;LVcPO组:动脉夹夹闭双侧肾蒂,45 min后再灌注前于大鼠舌静脉注射维生素 C 10 mg/kg,松开左侧动脉夹恢复血供,2 h后留取标本;MVcPO组:注射维生素 C剂量为 20 mg/kg,余同 LVcPO组;HVcPO组:注射维生素 C剂量为 40 mg/kg,余同 LVcPO组。

1.2.2 标本留取及指标检测 标本留取:再灌注 2 h时,打开大鼠胸腔抽取 2～4 ml心脏血后处死动物。将所抽血液置于抗凝管内,静置 4 h后以 4 500 r/min离心 15 min,分离血清,-20℃保存待用。分离左侧肾脏周围结缔组织后,以 4℃的0.9%氯化钠溶液冲洗表面血液,滤纸吸干表面水分,将肾脏纵剖成 2份,1份制备成 10%的组织匀浆,另 1份用 4%多聚甲醛固定后石蜡切片检测 NF-κBp65在肾组织的表达。指标检测:(1)肾功能:采用化学比色法检测血 BUN及 Cr。(2)肾组织氧化损伤和抗氧化指标:SOD检测采用黄嘌呤氧化酶法;MDA检测采用硫代巴比妥酸 (TBA)法;NO检测采用硝酸还原酶比色法。 (3)免疫组化测定 NF-κBp65蛋白表达:将标本切片脱蜡至水化、小牛血清封闭、滴加一抗、孵育、加二抗、加 SABC工作液、DAB显色,复染、透明、封固,光镜下观察,细胞质或细胞核内有棕色颗粒沉积为 NF-κBp65表达阳性,以已知阳性片作为阳性对照,用 PBS代替一抗作为阴性对照。染色标记强度用光密度值 (OD)表示。以上所有检测步骤严格按照说明书要求进行。

1.3 统计学方法 运用 SPSS 11.0对数据进行统计学分析,结果以 (x±s)表示,多组均数间比较采用单因素方差分析,组间两两比较应用 q检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清 BUN和 Cr水平变化 与 Sham组比较,RIR组血BUN和 Cr水平升高 (P＜0.01);与 RIR组比较,LVcPO组、MVcPO组、HVcPO组的 BUN和Cr水平降低 (P＜0.05,见表1)。

2.2 肾组织 SOD、MDA、NO的变化 与 Sham组比较,RIR组 SOD活性下降 (P＜0.01),MDA、NO水平升高 (P＜0.01)。与 RIR组比较,LVcPO组、MVcPO组、HVcPO组的SOD活性上升 (P＜0.05);MDA、NO水平下降 (P＜0.05,见表 2)。

表 1 各组大鼠血BUN和 Cr水平比较 (x±s)Table 1 Comparison of level of serum BUN and Cr in five groups

表 2 5组大鼠肾组织 SOD活性及 MDA和 NO水平比较 (x±s)Table 2 Comparison of level of SOD、 MDA、 NO in renal tissue in rats of five groups

2.3 肾组织 NF-κBp65表达 高倍镜下观察,Sham组肾组织 NF-κBp65有极少量的阳性表达;RIR组 NF-κBp65在肾小管上皮细胞阳性表达明显,有大量棕黄色颗粒,呈弥漫性分布,在肾小球未观察到明显棕黄色颗粒;LVcPO组、MVcPO组、HVcPO组阳性细胞较 Sham组增多,但较 RIR组明显减少,其中以 HVcPO组阳性细胞最少 (见图 1、图 2)。

图 1 光镜下肾组织NF-κBp65的阳性分布Figur e 1 Morphological observation of description of positive NF-κBp 65 in renal tissue

图 2 肾组织 NF-κBp65表达的变化Figure 2 The change of the expression of NF-κBp65 in renal tissue

3 讨论

在器官发生缺血再灌注损伤时,有多种因素参与了这一过程,其机制可能与氧自由基产生、细胞内钙超载、炎症反应和激酶的激活有关[4-5]。NF-κB是一种重要的核转录因子,广泛存在于各种真核细胞中。研究发现,体内、外的多种因素如氧自由基、炎症因子等均可调控 NF-κB的活化,而活化的NF-κB又调控着多种与生理、病理相关的基因表达,通过多种途径介导机体的炎性反应、免疫应答、氧化应激、细胞增殖与凋亡及自由基损伤等一系列病理反应。近年的研究显示,NF-κB的活化参与了缺血再灌注损伤[6]。静息状态下 NF-κB多以 p50和 p65二聚体与其抑制蛋白 IκB相结合而存在于胞质中,呈无活性状态。当受到肾缺血再灌注损伤产生的大量过氧化物和氧自由基等外源性刺激时,IκB迅速磷酸化而与NF-κB解离,活化的 NF-κB进入到细胞核激活介导炎症因子、细胞因子、黏附分子等多种基因的表达,直接或间接参与缺血再灌注损伤[7]。

NO作为一种新型生物信使分子,具有独特的理化性质和生物学活性,由一氧化氮合酶 (nitric oxide synthase,NOS)催化 L-精氨酸而产生。目前已知 NOS具有两类同工酶,即结构型 (cNOS)和诱生型 (iNOS)[8]。在正常生理情况下,由 cNOS介导产生少量的 NO,对肾脏具有直接保护作用,调节血管紧张性,抑制血小板聚集,清除氧自由基等。当肾 I/R损伤导致严重的内皮细胞受损时,cNOS诱导的 NO释放减少,同时再灌注时,产生的大量氧自由基对组织造成损伤并激活NF-κB,促进炎性递质的产生,可刺激 iNOS异常表达,催化产生大量的 NO,高浓度的 NO可与 O-2反应生成过氧化亚硝酸盐 (ONOO-),在酸性条件下又可分解成毒性更强的自由基如 NO-2和 OH-等,最终导致肾脏的病理性损伤。

氧自由基引发脂质和蛋白质过氧化生成 MDA,其生成和脂质过氧化相平行,因此 MDA含量的高低可反映肾组织细胞受自由基攻击的严重程度。SOD作为一个重要的抗氧化酶,可以歧化 O2-生成 H2O2。SOD作用的重要意义在于清除 H2O2和 OH-的前身 O2-,从而保护细胞不受毒性氧自由基的损伤。SOD活性的大小可反映机体清除氧自由基的能力。

本实验结果表明,Sham组肾组织及肾功能均无明显的病理变化,NF-κBp65的阳性表达也很少;而 RIR组肾小管内皮细胞水肿变性坏死,肾功能严重受损,肾组织 NF-κBp65的表达明显增强,NO水平明显升高。根据已有研究表明缺血后处理、药物预处理对心肌细胞的保护作用与氧自由基产生减少有关,在肝脏、脑、肠黏膜缺血再灌注损伤的研究中也有同样的趋势[9-10]。因此本实验采用维生素 C这一水溶性抗氧化剂来进行肾缺血再灌注损伤不同剂量药物后处理的研究。维生素 C能通过提供电子给·OH或 O2-,使之失活,变成低活性脱氧抗坏血酸,因而具有广泛的抗氧化损伤能力,且在组织受到氧化损伤时作为第一道防线最先被消耗[11]。实验发现经低剂量维生素 C后处理,血 BUN和 Cr水平,肾组织 MDA水平较 RIR组降低,SOD活性有所上升,同时肾小管内皮细胞水肿及坏死程度也较 RIR组减轻,提示可能此时肾组织内脂质过氧化损伤程度减轻,机体清除自由基的能力增强,以致 NF-κBp65的表达减弱,炎性递质的产生相应减少,其催化产生的 NO量也开始下降,最终使肾组织的损伤减轻。经中剂量维生素 C后处理,发现肾小管损伤程度显著改善,肾功能指标血 BUN、Cr水平,肾组织 MDA和 NO水平、NF-κBp65的表达较 RIR组明显下降,肾组织 SOD的活性较 RIR组明显升高。由此进一步证实肾小管上皮细胞 NF-κB的表达及肾组织 NO水平的变化与肾缺血再灌注损伤有着密切关系。实验发现经高剂量维生素 C后处理,肾小管损伤程度以及肾功能有更为明显的改善,血 BUN、Cr水平,肾组织 MDA和 NO水平、SOD活性、NF-κBp65的表达均与 MVcPO组相一致且表现得更加明显。此实验表明维生素 C后处理同样也有着明显的对肾缺血再灌注损伤的保护作用,抑制 NF-κB的表达,降低肾组织NO水平可能是其作用机制之一。通过低、中、高 3种不同剂量维生素 C后处理,发现随着药物剂量的增高对肾缺血再灌注的保护效果增强,呈明显的剂量依赖性,即后处理药物的剂量越高对肾缺血再灌注的保护效果越好,但这仅限于在本实验研究的剂量范围内,在此以外是否具有剂量 -效应关系有待进一步研究。

1 Murry CE,Jennings RB,Reimer KA.Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J].Circulation,1986,74(5):1124-1136.

2 Zhao ZQ,Joel SC,Michael EH,et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic p-reconditioning[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,285(2):579-588.

3 Yang XM,Proctor JB,Cui L,et al.Multiple,brief coronary occlusions during early reperfusion protect rabbit hearts by targeting cell signaling pathways[J].J Am Coll Cardiol,2004,44(5):1103-1110.

4 唐铁龙,卢一平,周棱,等 .缺血后适应对大鼠早期急性肾缺血再灌注损伤的保护作用 [J].移植杂志,2006,4(3):131-135.

5 Sun K,Liu ZS,Sun Q.Protective effect of ischemic postconditioning on hepatic ischemia reperfusion injury[J].Medical J of Wuhan University,2004,25(2):104-107.

6 Zhuang Rong,Lin Meng-xiang,Song Qiu-ying,et al.Effects of curcumin on the expression of nuclear factor-κB and intercellular adhesion molecular 1 in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury[J].J South Med University,2009,29(6):1153-1155.

7 Bannes PJ.Nuclear factor-kappa B:a pivotal transcription factor in chronic inflammatory diseases[J].N Engl J Med,1997,336(15):1066-1074.

8 Gabbai FB,Hammond TC,Thomson SC,et al.Effect of acute iNOS inhibition on glomerular function in tubulointerstitial nephritisnitric oxide in ischemia-reperfusion injury in the rat kidney[J].Transplant Proc,1995,27(1):754-759.

9 Zhao Yang,Dai Chao-liu,Peng Song-lin,et al.Influenceof Shen-Fu injection on the levels of iNOSand NO in hepatic ischemia reperfusion rat[J].Progress of Anatomical Sciences,2009,15(2):138-140.

10 张春兵,丁兴,詹瑧.盐酸川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用 [J].江苏中医药,2008,40(4):1622-1623.

11 Rojas C,Cadenas S,Herrero A,et al.Endotoxin depletes ascorbic in the guinea pig heat protective effects of VitCand E against oxidative stress[J].Life Science,1996,39(8):649-650.