HPLC-ELSD法测定枸骨叶中熊果酸的含量

2010-07-13刘宇文殷红妹邹耀华

天津中医药 2010年1期

刘宇文，殷红妹，邹耀华

（浙江省杭州市药品检验所中药室，杭州 310017）

枸骨叶为冬青科Aquifoliaceae冬青属Ilex L.植物枸骨 Ilex cornuta L indl.Ex.Paxt.的干燥叶，《中国药典》2005年版一部收载本品具有清热养阴，平肝，益肾的功效[1]。现代药理学研究表明，枸骨叶具有抗生育，扩张冠状动脉，抗菌等作用。大量的植物化学研究揭示了三萜及其苷类是枸骨叶中的主要活性成分。然而对于该植物的质量控制分析却鲜有报道,仅1995年郭亚健等报道了采用薄层扫描法对不同采收期枸骨叶中熊果酸的含量测定[2]，但因枸骨叶中还含有齐墩果酸，两者同属三萜酸，性质与化学结构较为相似，薄层色谱（TLC）法定量时，两者相互干扰，并且熊果酸在紫外区同属末端吸收，采用高效液相色谱－紫外（HPLC－UV）法测定效果也不太理想。本实验首次采用蒸发光散射检测器（ELSD），用高效液相色谱法对枸骨叶中熊果酸进行测定，并进行了方法学考察，获得了满意的结果。本研究选择在枸骨叶中大量存在的三萜类化合物熊果酸为指标，从而为评价枸骨叶药材的质量提供新的方法和科学依据。

1 仪器与试剂、试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪，AlltechELSD 400型蒸发光散射检测器。甲醇（色谱纯，Tedia公司，美国），水（超纯水），醋酸铵（分析纯，上海金赛医药化工有限公司生产）。熊果酸对照品（110742－200516，中国药品生物制品检定所），枸骨叶样品采自杭州，由本所殷红妹副主任药师鉴定。

2 方法

2.1 对照品溶液的制备精密称取熊果酸标准品10.80 mg,置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，摇匀。

2.2 样品溶液的配制取60℃干燥的枸骨叶粉末（过3号筛）约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定质量，回流提取0.5h，再称定，并用溶剂补足，摇匀过滤，即得。

2.3 色谱条件色谱柱：phenomene×C18柱（4.6mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇：0.5%醋酸铵溶液（92∶8）；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；ELSD 漂移管温度∶60℃，雾化气体为空气：3.56bar；放大系数（Gain）：4，在此色谱条件下，熊果酸峰与干扰峰完全达到基线分离（R＞1.5），理论板数以熊果酸峰计在5000 mm以上。对照品溶液色谱图见图1，样品色谱图见图2。

图1 对照品溶液色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of standard substance

图2 样品色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of sample

3 结果

3.1 线性关系考察精密吸取熊果酸标准品溶液3、5、10、15、20、30 μL 进样，注入液相色谱仪测定。以峰面积积分值的自然对数值为纵坐标、进样量（μg）的自然对数值为横坐标，采用双自然对数法进行线性回归。结果熊果酸线性回归方程为Y＝1.4667X＋2.6213（r＝0.9998），线性范围为 0.648～6.48 μg。

3.2 精密度实验精密吸取同一对照品溶液10 μL，重复进样，6次，熊果酸峰面积平均值为1582.3[相对平均标准偏差（RSD）＝ 1.5%]。

3.3 稳定性实验取同一供试品溶液，精密吸取5 μL，每隔2 h测定1次，熊果酸峰面积平均值为1597.8（RSD＝2.0%），说明供试品溶液在 24 h 之内基本稳定。

3.4 重复性实验取同一样品6份，分别按2.2项下方法操作测定。结果样品中，熊果酸平均含量为1.29%（RSD ＝1.6%）。

3.5 加样回收率实验取3.4项下已知含量的供试品（1.29%）6份，各精密加入熊果酸对照品一定量，照供试品溶液的制备法进行处理，测定其中熊果酸的含量。结果熊果酸的平均加样回收率为97.1%（RSD＝1.7%）。结果见表1。