张志国,李 冬,方 芳

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)

苯巴比妥、苯妥英钠、卡马西平均为临床常用的抗癫痫药物,它们的治疗窗均较窄,血清药物浓度易受多种因素影响,个体差异较大,临床需要个体化给药,为了按国家要求开展药物血清浓度监测 ,我们对文献[1～3]报道的检测方法进行了验证比较 ,在浓度,进样量等因素进行修改后,最终确定了适合于本院应用的检测方法。

1 仪器及试剂

大连依利特 P230Ⅱ高效液相色谱仪,UV230Ⅱ紫外-可见检测器,EC2006色谱数据处理工作站。色谱纯甲醇：天津凯通化学试剂有限公司生产;苯巴比妥对照品,批号：9201、苯妥英钠对照品,批号：100210-200401、卡马西平对照品,批号：100142-199503,三种对照品均为中国药品生物制品检定所提供;其它试剂为分析纯。

2 方法及结果

2.1 标准贮备溶液的制备

精密称取苯巴比妥25mg和苯妥英钠15mg,分别用甲醇溶解定容至 100mL(含苯巴比妥 0.25mg/mL,苯妥英钠0.15mg/mL);取卡马西平40mg,用甲醇溶解定容至 100mL,精密量取5mL,用甲醇定容至25mL(含卡马西平0.08mg/mL),置4℃冰箱保存 ,作为标准贮备溶液。

2.2 样品溶液的制备

标准品溶液的制备：于1.5mL具塞尖底塑料离心管中,加苯巴比妥贮备溶液20μL、苯妥英钠贮备溶液 20μL、卡马西平贮备溶液20μL,加甲醇至 720μL,旋涡振荡 5min混匀 ,作为标准溶液。

加样血清溶液的制备：采集健康人血液于无抗凝剂的真空管中,室温放置30min,待血液凝固后,以 3500r/min离心15min,分离出空白血清,取该血清200μL置于1.5mL具塞尖底塑料离心管中,加入苯巴比妥、苯妥英钠及卡马西平贮备溶液各20 μL,加甲醇至720μL,旋涡振荡5min,3500r/min离心5min,取上清液作为样品溶液。

空白血清溶液的制备：按加样血清溶液的制备方法制备不含药品的空白血清溶液。

2.3 色谱行为

HYPERSIL C18色谱柱：(4.6mm× 250mm,5μm);流动相：甲醇-水(47：53);流速：1.0mL/min;检测波长：205nm;柱温：35℃;进样量：15μL。分别取血清溶液和空白血清溶液,按色谱条件进样,结果如图1。

图1 专属性试验色谱图

加样血清溶液色谱图在与标准品溶液色谱图相应保留时间处均有吸收峰出现,空白血清溶液在与标准品溶液吸收峰相应的保留时间处没有吸收峰出现,表明其他杂质对检测没有干扰。分离度、拖尾因子等均符合药典[1]要求。

2.4 线性关系与最低检测限

按照样品溶液制备方法制备,分别以三种药品标准贮备溶液之一为内标测定其他两种药品,内标加入量均为20μL,各药品标准贮备溶液加入量分别为：苯巴比妥5.0～ 38.0 μL、苯妥英钠 8.0～ 32.0 μL、卡马西平 8.0～ 35.0 μL,按照色谱条件进样,在上述浓度范围内,计算各自的标准浓度(Y)对其峰面积与内标峰面积比值(X)的线性回归方程。以卡马西平和苯妥英钠为内标,苯巴比妥为：Y= 13.817X+ 1.1401(r=0.9945),Y= 19.737X- 0.4667(r= 0.9973);以卡马西平和苯巴比妥为内标,苯妥英钠为：Y= 10.737X+ 2.1512(r= 0.9939),Y= 26.427X+ 0.0045(r= 0.9991);以苯妥英钠和苯巴比妥为内标,卡马西平为：Y= 10.822X-0.1443(r= 0.9945),Y= 14.584X+ 0.0961(r= 0.9984)。按本法检测,苯巴比妥最低检测限为6.3225 μg/mL、苯妥英钠最低检测限为 6.084μ g/mL、卡马西平最低检测限为3.2056μg/mL。

2.5 回收率试验

分别以卡马西平、苯妥英钠和苯巴比妥为内标,加入量分别为相当于血清含量8.014μ g/mL、15.21 μg/mL、25.29μg/mL。按样品溶液配制方法分别配制含苯巴比妥 ,苯妥英钠和卡马西平高、中、低三种浓度的血清样品;根据所得峰面积按公式[1]。

根据测定所得峰面积按公式[1]：

含量 CX=f(Cx样品浓度、Ax样品峰面积、Ac内标峰面积、Cc内标物浓度 )和各样品 f值计算回收率 ,结果卡马西平为内标本巴比妥和苯妥英钠平均回收率为100.90%和100.50%;以苯妥英钠为内标时苯巴比妥和卡马西平平均回收率为99.81%和101.10%;以苯巴比妥为内标时苯妥英钠和卡马西平平均回收率为100.40%和101.40%。

2.6 精密度试验

取回收率试验高、中、低三种浓度的血清样品各 3份,分别于同1d及3d内按色谱条件进样,测得平均日内精密度为：苯巴比妥 RSD=0.84%、苯妥英钠 RSD=0.93%、卡马西平RSD=0.86%;平均日间精密度为：苯巴比妥 RSD=1.21%、苯妥英钠 RSD=1.69%、卡马西平 RSD=1.16%;表明本法重现性好,结果稳定。

3 讨论

流动相试剂及比例参考文献确定,甲醇用量增加或减少均会引起峰型变化,以现在比例峰型最好。样品中加入空白血清后峰型好于加空白血清前。进样量按照试验实际确定,在进样 20μL时三种药品均会出现双头峰,改为进样15μL后克服了此缺点;提高进样药品浓度不会引起峰型变化。对照品和内标物加入浓度按照血液中药品有效浓度范围[4]的中间浓度确定,低于报道[2]的检测浓度。综上所述,该方法试用于临床血液中药物浓度检测具有可行性。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[S].北京：化学工业出版社,2005,28

[2]杜青云,陈锦珊,黄惠丽.反相高效液相色谱法同时测定三种抗癫痫药空白血清浓度[J].解放军药学学报,2004,23(5)：334

[3]李影林.中华医学检验全书 [M].北京：人民卫生出版社,1996,978

[4]陈新谦.新编药物学[M].北京：人民卫生出版社,2007,219,235