傅 昱，郝晓芳，卢曾军，孙 普，胡永浩，刘在新

（1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070；2.中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃 兰州 730070）

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、母猪繁殖障碍（Sow abortion and mortality syndrome，SAMS）、猪皮肤肾病综合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、呼吸道综合征等相关疾病的重要病原[1-2]。PCV2是一种免疫抑制性病毒，损害感染猪的免疫功能，引起继发或者合并感染，对牲猪养殖业造成了难以估计的损失，该病毒已成为制约我国牲猪养殖业发展的重要病原之一[3]。由于病毒经常是并发感染，以亚临床感染形式出现，所以在很长的一个时期内往往被人们所忽视，因此进一步加强对PCV病毒的流行病学及分子生物学研究显得尤为重要[4]。

PCV病毒的ORF2阅读框表达的蛋白具有较好的免疫原性，并且该蛋白在两型病毒之间的同源性可达到68%。Nawagitgul P等将ORF2基因克隆到杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中表达了ORF2主要结构蛋白,相对分子质量为30 KDa,与在纯化的病毒粒子中检测到的相似,并在电镜下观察到重组的ORF2蛋白自身装配成衣壳样粒子,从而进一步证实ORF2基因编码病毒的衣壳蛋白[5]。

1 材料与方法

1.1 材料

兰州本地病毒分离株来自笔者在实验室保存的PK15细胞系和兰州地方某猪场的4份患PMWS的仔猪组织病料；pGEM-T Easy载体、BamH I和EcoR I限制性内切酶、DH-5 α感受态细胞购自大连宝生物工程有限公司；pET-32 a载体购自Novagen公司；BL21感受态细胞购自Promega公司；IPTG等其余实验所用试剂由本实验室保存并提供；DNA提取试剂盒和PCR试剂盒购自上海生工；质粒提取试剂盒购自BioDev公司；凝胶回收试剂盒购自AxyGen公司；引物P1，P2由上海生工生物有限公司按要求合成；PCV病毒ORF2序列的优化合成序列由南京金斯瑞生物技术有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 本地分离毒株ORF2片段PCR检测分析根据GenBank所查的PCV病毒两个型的ORF2的序列，设计了一对共用引物：P1：5′—TTCTCTGAATTGTA CAT—3′；P2：5′—CAAGGAGGCGTTACCGCAG—3′。进行了PCR扩增检测，将阳性病料接种于PK15细胞。盲传5代后收毒进行PCR扩增后回收、连接pGEM-T Easy载体、转化到DH-5α感受态细胞得到重组质粒进行序列测定和同源性分析。回收操作按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒说明书，质粒提取按照BioDev-Tech试剂盒说明书。

1.2.2 本地毒株ORF2序列的改造和合成 结合GenBank 所查 EU418627、DQ915583、EF565346 和GQ911590等4个PCV2的ORF2序列，对本地毒株ORF2序列进行了改造，将序列长度增长，加入PCV2的ORF2几个特异性的抗原表位序列，这样改造是由于在PCV2发病的仔猪组织中可以同时检测出大量的PCV1[6]，表明PCV1和PCV2的共存性，但是由于PCV2对致病性起决定性作用，所以序列要更好的针对PCV2的ORF2序列。应用DNAstar序列分析软件分析，对测序结果进行改造加入PCV2的ORF2特异性表位序列，并对稀有密码子进行改造（表1）。

表1 密码子的改造

1.2.3 合成后重组质粒的检测及pET-32a载体的连接 重组质粒菌液接种于氨苄培养基，培养过夜后挑选菌落提取质粒，对阳性质粒进行了BamH I和EcoR I双酶切鉴定，同时pET-32a空载体也进行了BamH I和EcoR I双酶切，然后将目的ORF2序列回收后连接到pET-32a表达载体多克隆位点中。

1.2.4 ORF2-pET 32 a重组质粒的获得及转化将连接产物ORF2-pET 32a转化到DH5α通用感受态细胞中，并进行氨苄培养基培养，然后通过质粒提取操作得到了阳性重组质粒ORF2-pET 32a。再将ORF2-pET 32a重组质粒转化入BL21（DE3）感受态细胞中，得到BL21(DE3)中阳性重组质粒。

1.2.5 ORF2-pET 32a的表达鉴定 挑取含ORF2-pET 32 a阳性重组质粒的BL21(DE3)重组表达菌的单个菌落，接种于含氨苄青霉素（AMP）的液体LB培养基中，25℃ ，200 r/min低温振荡培养至 OD600为 0.6～0.7（约 2 h）时，加入 2 mmol/L的 IPTG（Isopropylthio-β-D-galactoside） 后继续25℃诱导表达5 h,取表达产物按常规方法进行SDS-PAGE电泳。

1.2.6 融合表达产物的可溶性分析 采用以上方法将诱导表达产物于4℃10 000 r/min低温离心10 min，收集诱导表达菌体加入PBS溶液，于冰浴中25%强度，8 s超声破碎8 s。停止冷却，循环超声破碎45 min，超声结束后于4℃，10 000 r/min低温离心10 min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳鉴定融合表达产物的可溶性。PBS溶液按常规剂量自行配制。

1.2.7 重组融合蛋白的纯化及浓度的测定 经可溶性鉴定该表达产物主要以上清的形式存在，将扩大诱导培养后额菌液以10 000 r/min离心10 min，超声破碎取上清。使用ProBond TM纯化柱进行纯化，具体纯化方法见Invitrogen公司的Ni+纯化手册。对纯化后产物用蛋白核酸定量仪测定蛋白质样品在260 nm和280 nm波长的光吸收值，按照以下计算样品中蛋白质含量的公式：蛋白质浓度（mg/mL）=1.45×A280－0.74×A260。测定浓度后的产物小量分装冻存于-40℃。纯化用液按Invitrogen公司的Ni+纯化手册，由本研究自行配制。

1.2.8 纯化后重组融合蛋白的Western blotting分析 根据蛋白技术手册所介绍的蛋白质免疫印迹法的操作步骤安装转印装置，将SDS-PAGE电泳的蛋白条带转移至硝酸纤维素滤膜（NC）上，用含1%BSA的TBST溶液封闭，以PCV2猪阳性血清为一抗，HPR标记的兔抗猪IgG为二抗，DAB(2 mg NiCl2，15 μL 30%H2O2，5 mL 0.01 mol/L Tris-HCl（pH=7.6）液体避光染色，并照相。

2 结果与分析

2.1 本地分离毒株ORF2片段PCR检测、酶切鉴定

将接毒后病变PK细胞液提取的重组质粒用Hind III和BamH I限制性内切酶进行双酶切后，进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳，得到电泳结果图（图1）。结果表明，本地分离毒株中有PCV病毒的存在。

图1 重组质粒双酶切鉴定

该片段测序后经GenBank序列比对及DNAstar软件分析，结果表明，本地分离毒株为PCV1毒株，毒株ORF2序列长度662 bp，编码了221个氨基酸。测序分析后发现分离毒株序列与PCV1的ORF2序列同源性达到99.1%～99.4%。

2.2 重组质粒的检测及pET-32a载体的连接

将改造合成后的本地毒株ORF2序列重组质粒进行BamH I和EcoR I双酶切鉴定（图2）。将酶切后ORF2片段连接pET-32a多克隆载体，通过双酶切鉴定电泳（图3）。如图所示，目的ORF2片段已经准确的连入pET-32a载体。

图2 重组质粒pUC-ORF2的酶切鉴定

图3 ORF2-pET 32a双酶切鉴定

2.3 ORF2-pET 32a重组质粒转入BL21后的表达鉴定

将转入BL21（DE3）中的阳性ORF2-pET 32a重组质粒单菌落进行诱导表达，将诱导前和诱导后培养物分别取出1.0 mL并收集菌体进行SDSPAGE分析，电泳分析结果（图4）。

图4 重组蛋白SDS-PAGE分析

由SDS-PAGE电泳图可以看出，重组菌在诱导后出现一条大约为50 kDa的蛋白条带，大小与预期的融合蛋白分子量基本一致，这表明诱导表达得到了所需的ORF2-pET 32a表达蛋白。

2.4 融合表达产物的可溶性分析

将诱导表达产物收集菌体超声破碎后离心得到上清液和包涵体沉淀，对其进行了SDS-PAGE分析（图5），表明目的融合蛋白重要存在于上清液中。

2.5 重组融合蛋白的纯化及浓度测定

对重组融合蛋白进行了纯化操作，纯化后SDS-PAGE电泳（图6），图中纯化后有一条明显的50 KDa左右的条带，表明纯化效果良好。对蛋白进行蛋白核酸定量仪测定，按照计算公式得出蛋白的浓度达到459 μg/mL，达到了纯化蛋白浓度的预期目的。

图5 ORF2-pET 32a融合蛋白可溶性鉴定

图6 重组融合蛋白纯化后的SDS-PAGE检测

2.6 Western blotting分析

对重组融合蛋白的纯化产物进行了Western blotting分析（图7）。结果表明，NC滤膜上在50 kDa的目标条带位置上出现了一条明显的棕色印迹，而pET 32a空载体转化菌落在相应的50 kDa并没有出现任何条带，说明该纯化后的重组融合蛋白可以特异性的被多克隆抗体识别，重组融合蛋白的抗原性良好。

图7 纯化产物Western blotting分析

3 讨论

3.1 对兰州本地毒株的检测和鉴定分析

由于采集的病料分离毒株毒力较弱，运输环节储存时间较长，病毒的数量较少，从而导致PCR扩增不敏感、基因组扩增和克隆不稳定，因此本研究将分离毒株细胞毒复苏，重新接种于PK15细胞上，进行病毒的增值培养和传代，待病毒增值在PK15细胞中稳定以后，将获得的新鲜病毒用于PCR检测。研究表明PK15细胞是体外培养PCV的良好细胞株，PCV1和PCV2在PK15细胞上复制，都不产生细胞病变（CPE）[7]。PCV可以来源于骨髓、外周血液、肺洗液和淋巴结的单核、巨噬细胞中。本试验从兰州本地病料分离株提取出来DNA进行扩增，对扩增后的ORF2序列进行了测序，对测序结果和几个genbank登录毒株的ORF2进行了比较分析，ORF2序列的长度为662 bp，可以表达221个氨基酸。根据DNAstar软件中MegAlign的分析，本地分离株ORF2的序列与PCV1的ORF2序列EF533941，FJ475129，DQ648032 和 AY193712 的同源性达到了99.1%～99.4%，而与PCV2的ORF2序列 EF565346，GQ911590，EU418627 和 DQ915583的同源性是68.1%～68.6%。这个结果表明兰州本地分离株的ORF2测序结果判定病毒为PCV1病毒。此项工作为兰州本地区PCV病毒的流行病调查研究工作做出了一定的补充。

对本地株ORF2序列的改造，遵循了使改造后基因表达的蛋白更好的特异性的识别PCV2病毒的原则，同时对PCV2基因疫苗的制备做一些前期的准备工作。据文献报道，ORF2所编码核衣壳蛋白的65 aa～87 aa、113 aa～147 aa、157 aa～183 aa区域及 C端的4个氨基酸残基为重要的抗原结构[8-9]。对非以上抗原结构区域的稀有密码子进行了改造，目的是为了更有利于基因的表达得到重组融合蛋白。改造后合成的ORF2序列可以指导234个氨基酸的合成。根据文献上报道的ORF2基因编码的N端41位氨基酸为核定位信号[10]，将此区域的密码尽量保证为原始编码，这样能更好的保证其指导表达的蛋白的抗原性。

3.2 对改造合成基因的表达、纯化和分析

T7表达系统是目前所有表达系统中公认的表达效果最好的系统，也是世界各国基因研究中应用最多的表达系统。pET系列是典型的代表，其中pET 32a是目前在兽医领域应用的比较广泛的一种，在基因表达领域，膜蛋白的原核表达是一个公认的瓶颈[11]。pET 32a是含有T7启动子和Amp（氨苄）抗性基因的原核高效表达载体，表达后的融合蛋白带有His·Tag标签受lac阻断物的调节，在含有lacI基因编码的宿主菌中可以用IPTG去抑制，在对数生长期（OD600=0.6）加入诱导剂IPTG后基因开始表达。根据蛋白可溶性分析，本研究表达融合重组蛋白是可溶性形式存在，虽然富集纯化过程较为简单，但是可溶性的蛋白在纯化过程中更容易收到蛋白水解酶的影响，所以在纯化和存放的时候在融合中要按1/1 000的比例加入蛋白酶抑制剂。并保证操作过程中温度角度，而且试验步骤要尽量缩短操作和静止时间[12]。

表达时运用了BL21（DE3）宿主细胞，是因为BL21（DE3） 宿主细胞可识别 AGG、AGA、AUA、CUA、CCC、GGA 6种稀有密码子，而基因合成前的进行基因改造时就考虑到了以上情况，对核定位区等重要区域尽量保证其为原始编码，并对其他区域表达相同氨基酸的密码子尽量改造为宿主细胞可识别的密码子。融合表达蛋白的可溶性受基因本身、诱导条件、环境条件等因素的影响，本研究中使用的是25℃，220 r/min的低温诱导表达方式获得了可溶性表达蛋白。根据文献所述，基因组成是影响表达和蛋白质可溶性的重要因素[13]。

镍螯合层析可以在超声破碎后变性条件下纯化带有His·Tag标签的重组蛋白。而重组蛋白N端或者C端带有一个或者多个组氨酸（由密码子CAT和CAC编码）时[14]，其具有强的镍离子亲和力，作用甚至大于抗原抗体的亲和力。一些不带有His·Tag标签，但组氨酸位于蛋白结构表面的、具有较强可近性的蛋白也可以与镍离子发生结合，所以镍螯合层析纯化常出现较强的非特异性杂蛋白影响纯化效果。本研究SDS-PAGE电泳中第1电泳道隐约能看到的杂带可能就是由于以上原因，但是由于与目的蛋白距离较远，可以后期进行切胶纯化去除，对纯化效果影响较小。用PCV2阳性多克隆猪血清对纯化后的重组融合蛋白与诱导后的重组融合蛋白进行了Western blotting免疫检测分析，结果表明，纯化后蛋白特异性的识别PCV2的多克隆阳性血清，但除了目的蛋白条带外，隐约还有其他菌体蛋白条带也与PCV2病毒多克隆阳性血清抗体呈较弱的阳性反应，这可能因为阳性血清中含有针对大肠杆菌菌体蛋白的抗体。融合蛋白的成功纯化和Western blotting分析为PCV2感染临床诊断和PCV2检测方法的建立奠定了基础，也为PCV2基因疫苗的制备补充了理论依据。

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