刘震 梁靓 窦鹏 卞宁生 柯晓康 章文伟

(南京大学化学化工学院 江苏南京210093)

核酸酶酶解-高效液相色谱法分析DNA碱基组成*
——介绍一个综合化学实验

刘震 梁靓 窦鹏 卞宁生 柯晓康 章文伟

(南京大学化学化工学院 江苏南京210093)

介绍一个分析化学与生物化学交叉的综合化学教学实验及其教学方案的设计思路。该实验以高效液相色谱和核酸酶为工具，分析DNA的碱基组成。通过改革实验教学设计，加深学生对各个知识点的理解与运用，培养学生分析问题和解决问题的能力。

DNA由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)4种碱基组成。G+C的含量在生物化学、微生物学和分子生物学等领域具有重要意义，不同生物体中的DNA具有特定的(C+G)%值，DNA的熔解温度(Tm，PCR扩增的重要参数)和DNA的均一性都与(C+G)%值紧密相关。高效液相色谱(HPLC)是现代分析实验室必备的分析仪器;酶解反应是生物化学以及生命科学研究中的重要工具。利用核酸酶酶解－高效液相色谱分析法［1］，可以对DNA的碱基组成进行分析。该方法已经相当成熟［2］，并被国外教材采用为大学化学实验［3］。但是，以往的实验目的主要强调用HPLC法测定DNA的碱基组成，并测定Tm值。本实验通过改革实验教学方案与教学方式，对实验内容和实验要求进行了创新设计，能够加深学生对实验中各个知识点的理解与运用，同时可培养学生分析问题和解决问题的能力。

1 实验原理

(1)核酸酶P1能水解单链DNA或RNA的3'－5'磷酸二酯键，将其定量降解为4种核苷酸，化学反应见图1。但核酸酶P1不能水解双链DNA。

(2)碱基配对原理:在DNA分子中，C通过氢键与G配对，A通过氢键与T配对。因此，C与G浓度相等，A与T浓度相等。

(3)将DNA的稀盐溶液加热到80～100℃，双螺旋结构发生解体，变成两条单链，这一过程称为热变性。DNA的变性发生在狭小的温度范围内，是个相变过程。通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的熔点或熔解温度，用Tm表示。DNA的Tm与其(G+C)含量成正比关系，(G+C)含量越高，Tm越高。这是因为G与C配对时形成3个氢键，而A与T配对时只形成2个氢键。(G+C)%与Tm间存在一个经验关系［4］:

(4)DNA的复性:在适当的条件下，变性后的DNA的两条彼此分开的链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。经过热变性后的DNA，若缓慢冷却，可以复性;但若在冰浴中骤然冷却，则不能复性。

图1 核酸酶P1催化核酸的水解反应

(5)根据被测组分在流动相和固定相间相互作用强度的不同，可用HPLC将被测组分分离，与固定相相互作用弱的组分先流出色谱柱，与固定相相互作用强的组分后流出色谱柱。核苷酸的混合物可以采用离子交换色谱或反相色谱实现基线分离，本实验采用反相HPLC。

(6)以鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP，简写为G)为内标，根据标样的峰面积利用归一化法计算胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP，简写为C)，胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP，简写为T)，腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP，简写为A)的响应因子(F):

式中，AC、AG、AA、AT分别为C、G、A和T的峰面积，［C］、［G］、［A］、［T］分别为C、G、A和T的浓度。根据酶解后的DNA样品的峰面积和相应的响应因子可计算出C、T、A的浓度，并计算(C+G)的分数:

2 实验目的

让学生进一步掌握高效液相色谱实际应用、学习酶解的实际操作，培养学生应用分析化学方法和生物化学知识解决实际问题的能力。

3 仪器与试剂

(1)高效液相色谱仪(紫外吸收检测器，波长260nm)，反相色谱柱(C18)。

(2)恒温水浴(室温～100℃)。

(3)冰浴。

(4)未知DNA样品:固体或1mg/mL水溶液(1mL)。

(5)核酸酶 P1:5units/mL溶于含0.5mmol/L ZnCl2的50mmol/L乙酸钠缓冲溶液(pH 5.3)。

(6)核苷酸混合标样，含dGMP、dAMP、dCMP和dTMP各0.4mmol/L。

(7)核苷酸单一标样，分别含0.4mmol/L的dGMP、dAMP、dCMP或dTMP。

(8)流动相:含适量有机溶剂的10mmol/L磷酸钾缓冲溶液，pH 7.2(有机溶剂的含量与色谱柱的品牌有关，一般为0～5%的甲醇或乙腈)。

4 实验要求

现有一未知DNA样品(对学生是未知的)，应用本实验介绍的生物化学知识和本实验提供的实验条件，自行设计实验方案，完成实验并回答下列问题，要求实验步骤数越少越好(运行1次HPLC分析为1个步骤，平行实验视为1步):

(1)该样品是单链DNA，双链DNA，还是两者的混合物?证据是什么?

(2)若该样品中含有两条单链DNA，如何证明这两条单链是由原来互补的DNA双链变性而来还是两条不互补的单链DNA?

(3)测定该DNA样品的(G+C)%，求算该DNA的溶解温度(Tm)。

5 思考题

(1)计算相对浓度［C］/［G］、［T］/［G］和［A］/［G］。［C］/［G］的理论值应为多少?［T］/［G］和［A］/［G］间的理论关系是什么?

(2)对于相同的DNA，利用单链和双链测得的(G+C)含量相同吗?为什么?

(3)注意观察在不同条件下得到的色谱图，比较色谱图的变化，是否观察到一些同你的预期不符合的实验结果或现象?若有，如何解释?

6 教学设计特点

本实验属于分析化学与生物化学相结合的综合化学实验，在教学设计上主要有以下特点:

(1)教学内容“问题化”，易激发学生的兴趣，使学生积极参与，成为实验教学的主体。通过对分析化学和生物化学相关知识的主动认识与实际应用，建立起真正属于学生自己的知识，并培养学生应用知识的能力。

(2)学生自行设计实验方案，实验内容由学生自己做主。学生在自行设计实验方案时必须考虑实验内容中的每一个步骤。同时，通过分组讨论的方式，让学生相互评价各自的实验方案，最后由指导教师点评不同方案的共性、差异以及优劣之处。在此基础上，让学生适当更改，制定出最终的实验方案。在此过程中，指导教师只是点评、启发与引导，并不要求学生的想法与教师完全一致。

(3)多个知识点的综合运用。本实验涉及到的知识点有:高效液相色谱法、归一化法、核酸酶P1酶解原理、碱基配对原理、DNA的变性与复性、熔解温度的估算等。在整个实验中，学生需要多次综合运用这些知识点才能设计出合格的实验方案。在每一个实验步骤中，学生至少可以运用到一个知识点，从而有效地培养了学生利用所学知识解决实际问题的能力。

(4)多角度、全方位的能力培养。单从HPLC的角度看，实验内容仅涉及到定性分析与定量分析。但在整个实验过程中，学生的活动包括设计、实验、观察、分析等多方面内容。此外，学生还将学会统筹分配实验时间。

［1］ Katayama－Fujimura Y，Komatsu Y，Kuraishi H，et al.Agric Biol Chem，1984，48:3169

［2］ Wietstock SM.JChem Educ，1995，72:950

［3］ Harris D C.Quantitative Chemical Analysis.6th ed.New York:W.H.Freeman and Company，2002

［4］ 王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学.第3版.北京:高等教育出版社，2002

国家自然科学基金委国家基础科学人才培养基金“南京大学理科化学基地(J0630425)”