彭 涛，滕军放，关文娟，文全庆，张博爱，贾延劼

郑州大学第一附属医院神经内科郑州450052

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞，具有向骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、肌细胞、干细胞、脂肪细胞和造血细胞等多向分化和自我更新的能力，在体内及体外一定条件下可横向分化为神经元和胶质细胞［1］。Rho/Rho激酶(ROCK)信号通路是体内重要的信号通路，它通过调节细胞内肌动蛋白骨架的聚合状态而扮演着“分子开关”的角色，参与调节细胞骨架蛋白的合成、降解、移动和收缩等，对细胞的分裂、收缩、黏附、迁移及分泌等活动具有重要的调节作用［2-3］。作者观察了ROCK抑制剂盐酸法舒地尔体外诱导大鼠骨髓MSCs向神经元样细胞分化的效果，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物:成年Wistar雄性大鼠，体质量150～200 g，雌雄不拘，由郑州大学实验动物中心提供。主要试剂:高糖 DMEM培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自Hyclone公司，盐酸法舒地尔注射液由天津红日药业股份有限公司提供，神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF200)与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)兔抗大鼠多克隆抗体及兔抗大鼠Cy3免疫荧光染色试剂盒均购自Santa Cruz公司，其他生化试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 大鼠骨髓MSCs的分离培养、纯化及扩增 取Wistar雄性大鼠，颈椎脱臼处死后，体积分数75%乙醇浸泡5 min，无菌条件下分离大鼠两侧股骨和胫骨，暴露骨髓腔，以含体积分数15%胎牛血清的DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，3 000 r/min离心2 min，弃上清液，以培养基重悬细胞，制成单细胞悬液，以1×105mL－1的细胞密度接种于25 cm2的塑料培养瓶中，置于37℃饱和湿度、体积分数5%CO2的恒温培养箱中培养，48 h半量换液。待贴壁细胞完全融合后，以含1 mmol/L EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，按1×104mL－1的密度接种，每隔48 h半量换液。倒置显微镜动态观察骨髓MSCs的生长情况。传至15代后备用。

1.3 骨髓MSCs的诱导分化 根据预实验结果选用200 μmol/L盐酸法舒地尔诱导骨髓MSCs。取15～18代的骨髓MSCs，以2×104mL－1的密度接种于24孔板，当细胞融合度达70% ～80%时，用含终浓度200 μmol/L盐酸法舒地尔的高糖DMEM液诱导。设4个复孔，实验重复3次。

1.4 细胞形态学观察 倒置显微镜下动态观察诱导前及诱导30、60、90、120及180 min细胞形态学变化。

1.5 细胞存活率测定 吖啶橙(AO)与溴化乙锭(EB)分别用PBS溶解成100 mg/L的工作液，使用前按体积比1∶1混匀。诱导30、60、90、120及180 min，分别加入AO-EB混和液。荧光显微镜下(×100)随机计数5个非重叠视野，计算细胞存活率。

1.6 NSE、NF200与 GFAP的检测 40 g/L多聚甲醛固定诱导后60、90、120及180 min的细胞，4℃过夜，TBST洗涤3次。用含体积分数5%牛血清白蛋白的TBST封闭60 min。去除封闭液，分别滴加一抗NSE、NF200与GFAP兔抗大鼠多克隆抗体，工作浓度均1∶100，4℃过夜后洗涤。加入Cy3标记的二抗作用1 h，洗涤后在荧光显微镜下观察，随机计数5个非重叠视野(×200)，计算NSE、NF200和GFAP阳性细胞百分率。

2 结果

2.1 大鼠骨髓MSCs的培养和纯化 接种后24～48 h，骨髓细胞出现纺锤形改变，开始贴壁生长，随着培养时间延长，贴壁细胞明显增多并分裂增殖。7～10 d细胞胞体膨大，伸出长短不一、粗细不均多种形态的突起，细胞呈团簇状生长，分布不均，显示出集落生长趋势。经15～18次传代，形成较典型的骨髓MSCs。见图1。

图1 18代大鼠MSCs(×200)

2.2 诱导后的形态学变化 盐酸法舒地尔诱导后30 min细胞开始出现胞体收缩，细胞间隙增宽。诱导后120 min，形态变化最为理想，表现为胞体收缩成球形或锥形，折光性增强，部分细胞周围有光晕，有较多长突起，并连接成网状。继续延长诱导时间，神经元样细胞明显增多，但有少量细胞脱落、死亡(图2)。

图2 盐酸法舒地尔诱导30 min(A)和120 min(B)(×200)

2.3 诱导后细胞存活率 盐酸法舒地尔诱导30、60、90、120 及180 min后细胞存活率分别为(96.7 ±2.2)%、(95.3 ±1.9)%、(93.8 ±1.8)%、(92.5 ±2.1)%及(90.1 ±1.3)%。

2.4 NSE、NF200及GFAP测定 见图3。诱导后60、90、120及 180 min，NSE阳性表达率分别为(66.5 ±1.9)%、(88.1 ±3.2)%、(93.6 ±1.9)%和(93.5±5.4)%，NF200 阳性表达率分别为(70.1 ±2.9)%、(89.5 ±1.3)%、(98.1 ±1.6)%和(98.3 ±1.9)%，而GFAP阳性表达率均小于5%。

图3 诱导120 min NSE(A)、NF200(B)和GFAP(C)蛋白的表达(免疫荧光染色，×200)

3 讨论

目前诱导骨髓MSCs在体外分化成为神经细胞可采用细胞因子、基因转染和化学诱导剂等方法。但是前两者诱导时间长，获得神经元样细胞的百分率较低。作者观察了ROCK抑制剂盐酸法舒地尔诱导骨髓MSCs向神经元分化的可行性，结果显示，盐酸法舒地尔可在体外诱导大鼠骨髓MSCs向神经元样细胞分化，诱导后的细胞主要表达 NSE和NF200，GFAP表达较少，证明骨髓MSCs诱导后主要是向神经元细胞分化，而不是向胶质细胞分化。AO-EB染色和免疫荧光结果显示，盐酸法舒地尔的诱导效率及诱导后细胞存活率较高，且其诱导过程是连续的，诱导2 h后，细胞形态已有明显变化，省略了预诱导期，使诱导时间大大缩短。

近年来的研究［4-6］表明，骨髓MSCs的分化是通过一系列信号转导途径实现的。2006年，Pacary等［7］报道CoCl2联合ROCK抑制剂Y-27632可促进骨髓MSCs向多巴胺能神经元样细胞分化。2007年，Kamata等［8］在研究人神经母细胞瘤GOTO细胞时发现，Rho抑制剂胞外酶C3转移酶和法舒地尔可诱导轴突形成，促进GOTO细胞向神经元样细胞分化，推测GOTO细胞的分化和ROCK信号通路密切相关。骨髓MSCs的定向分化主要涉及细胞形态学的改变，细胞形态改变依赖于持续的细胞骨架的重建，肌动蛋白是细胞骨架的主要成分。Rho激酶是细胞骨架肌动蛋白的重要调节分子，并作为信号分子参与众多与细胞骨架有关的细胞信号传导。该研究首次证实ROCK抑制剂盐酸法舒地尔可以在体外快速、高效诱导大鼠骨髓MSCs向神经元样细胞分化。推测其机制可能为盐酸法舒地尔抑制了Rho激酶的活性，从而导致细胞骨架重建，启动细胞分化的过程，同时通过干扰ROCK信号通路与其他信号传导通路之间本来相对平衡稳定的内环境，关闭或激活下游途径中与细胞分化相关的基因，从而促进骨髓MSCs向神经元样细胞分化。

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［6］Brown JH，Del Re DP，Sussman MA.The Rac and Rho hall of fame:a decade of hypertrophic signaling hits［J］.Circ Res，2006，98(6):730

［7］Pacary E，Legros H，Valable S，et al.Synergistic effects of CoCl(2)and ROCK inhibition on mesenchymal stem cell differentiation into neuron-like cells［J］.J Cell Sci，2006，119(Pt 13):2 667

［8］Kamata Y，Hattori Y.Neural differentiation of human neuroblastoma GOTO cells via a Rho-Rho kinase-phosphorylation signal transduction and continuous observation of a single GOTO cell during differentiation［J］.J Vet Med Sci，2007，69(1):37