朱 艳 霞，刘 天 庆＊， 宋 克 东， 姜 丽 丽， 马 学 虎， 崔 占 峰

（1.大连理工大学 干细胞与组织工程研发中心，辽宁 大连 116024；2.牛津大学 工程科学系 组织工程与生物处理中心，英国 牛津 OX1 3PJ）

0 引 言

自2001年Zuk等[1]证实吸脂获得的脂肪组织中存在具有多向分化潜能的细胞群，脂肪干细胞（adipose－derived stem cells，ADSC）逐渐被人们认识并进入干细胞研究领域.ADSC具有与骨髓间充质干细胞相似的生物学特性，并且脂肪组织分布广泛、体内储备量大，可以多次取材并且损伤小，因此，ADSC作为组织工程和再生治疗的种子细胞前景十分广阔.

目前国内外对ADSC体外增殖及定向诱导分化能力认识还存在分歧，研究者们通过不同方法获得了不同量的脂肪干细胞[1、2]，要想获得高质、高量的ADSC，必须建立一套更简便有效的分离培养方法.另外，大多数研究显示ADSC的增殖周期是6～7 d，然而有研究表明ADSC在增殖2周过程中，细胞的蛋白合成率和总蛋白量一直持续增加[3].因此，ADSC的生长特性还有待进一步阐明.

本实验改进现有的ADSC体外分离培养方法，对其获得率、体外增殖能力等进行研究，以期ADSC为种子细胞的细胞治疗和组织构建提供细胞学基础.

1 材料和方法

1.1 脂肪干细胞的分离培养

自外科手术患者（年龄16～60岁）皮下获取正常脂肪组织，约500 mg，无钙镁 Hank′s液冲洗，用眼科剪尽量剪破脂肪组织中肉眼可见的细小血管，冲洗血液后剪碎脂肪组织，移入大玻璃管中，加入0.25%胰蛋白酶（sigma）和0.1%胶原酶（I型，sigma）（体积比1∶1），37℃恒温摇床振荡消化20 min.此时液面分为3层：上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体.吸出下层液体移入含完全培养基（10%胎牛血清（hyclone）＋高糖 DMEM （gibco））的离心管中终止消化.在剩余脂肪中加入新的胰酶和胶原酶，重复以上步骤继续消化，重复2～3次，将收集到的液体1500 r/min离心10 min，去除悬浮的脂肪细胞和脂滴，去上清，向细胞沉淀中加入含10%胎牛血清DMEM重悬细胞，移入培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱孵育，每2～3 d换液.细胞达到100%融合时，用0.25%胰酶和0.04%EDTA（体积比1∶1）消化传代.

1.2 细胞形态学观察

使用倒置显微镜（IX70－131，OLYMPUS）观察细胞生长，并对传代贴壁生长在培养瓶中的脂肪干细胞的生长、纯化情况及增殖进行连续观察、摄像.

1.3 细胞增殖动力学分析

将第4代ADSC以不同密度6.25×104、1.25×105、2.50×105、5.00×105、1.00×106和2.00×106cells/m L种于96孔板内，获得细胞密度与光密度值的标准曲线.以5.00×103cells/m L的密度接种细胞并分别检测和绘制第3、7和15代细胞的生长曲线.采用cck－8测量细胞增殖，每100μL培养液中加10μL无菌cck－8，孵育3 h后在酶联免疫检测仪上测各孔450 nm的光吸收值，参比波长630 nm.每组设置3个平行对照，实验重复3次.

当细胞传至20代时，分别将20代细胞按传统的每5 d传代1次（99%融合）和每14 d传代1次（此时细胞重叠生长），两种传代方法传代至25代时，分别绘制2个25代细胞的生长曲线.

1.4 累计群体倍增时间

根据生长曲线的指数增殖期计算群体倍增时间.群体倍增时间Td＝T×[lg 2/lg（Nt/N0）]，T代表生长曲线中的指数增殖时间段，N0是接种时的细胞数，Nt是指数增殖末期的细胞数.据此公式计算25代细胞的群体倍增时间Td.

1.5 细胞表面分子测定

取第4、20及2个25代细胞检测其干细胞相关表面标记的表达，操作步骤如下：培养的脂肪干细胞经过消化离心（1000 r/min，5 min）后细胞重悬；细胞计数后将细胞浓度调整为1×107cells/m L，分 别 与 人 抗 CD13－PE、CD29－PE、CD34－FITC、CD44－FITC、CD45－FITC、CD105－FITC、CD166－PE 和 HLA－DR－PE作用20 min，PBS洗涤2次后用PBS重悬细胞，流式细胞仪（BD，San Jose，CA，USA）进行检测.

1.6 逆转录聚合酶链式反应（RT－PCR）

分别提取第4、20、30及2个25代细胞的总RNA，用合成第1链cDNA试剂盒（Ta KaRa，日本）逆转录合成cDNA、Nanog、Oct－4、Sox－2和Rex－1的引物分别进行扩增，GAPDH作为参照.PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，Scion Image图像分析软件对电泳条带进行分析.

1.7 多向分化潜能的检测

1.7.1 成脂肪诱导 取第4代及2个25代细胞，以1×105cells/m L的密度接种于24孔板中.当细胞贴壁生长达80%融合时，换成脂肪诱导试剂[1]，对照组加常规培养液.诱导14 d进行油红染色以观察细胞脂滴形成情况.

1.7.2 成骨诱导 当细胞贴壁生长达80%融合时，换成骨诱导试剂[1].细胞诱导培养1周时进行钙钴法碱性磷酸酶 （ALP）染色，3周进行Von Kossa染色，干燥后镜下观察.

1.7.3 成软骨诱导 取第4代及2个25代细胞，调整细胞密度2×107cells/m L，取10μL滴于24孔板内，于37℃培养箱孵育3 h后加软骨诱导剂[1].诱导培养2周后进行甲苯胺蓝染色，干燥后显微镜下观察.

1.7.4 成心肌诱导 取第4代及2个25代细胞，以1×105cells/m L的密度接种于24孔板中.当细胞贴壁生长达80%融合时加9μmol/L 5－氮胞苷，作用24 h后换新鲜培养基继续培养4周.用心肌特异性连接蛋白Connexin－43进行免疫荧光检测，荧光显微镜下观察.

1.8 统计学分析

采用SPSS 12.0软件进行统计学处理，所有数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验.P＜0.05为有显著性差异.

2 结 果

2.1 细胞形态

接种后ADSC在24 h内开始贴壁，初为短梭形，细胞大小不等，核浆比例较大.2～4 d可见细胞伸展，大多数细胞为长梭形，形态类似成纤维细胞，核椭圆形，较大（图1（a））.原代培养的细胞3～4 d即达90%融合，传代后第3代细胞生长出现方向性（图1（b））；体外培养20代以后，细胞的增殖速度无明显减慢，细胞形态无明显改变（图1（c））；30代以后的细胞体积明显增大（图1（d））.

2.2 细胞增殖动力学

在本文的培养条件下，ADSC可传至30代以上.从图2（b）可以看出在最初3 d ADSC处于生长适应期，第4 d开始细胞进入对数生长期，然而第8 d后细胞处于生长停滞期.但与其他研究结果不同的是细胞并未出现接触抑制，而是继续增殖到第10 d时达到又一个增殖峰值.接下来的几天，细胞数量虽然有所减少，第12 d后细胞又进入另一个对数增殖期.从图2还可以看出，随着传代次数的增加细胞的增殖能力有所下降.图2（c）显示了两种传代方法得到的第25代细胞的生长曲线.与图2（b）类似，这两种细胞的生长曲线表现出多个对数增殖期和增殖峰值，两种方法得到的25代细胞都具有较强的增殖能力.

图1 体外培养的脂肪干细胞形态学改变Fig.1 Morphology change of h ADSCs from subcutaneous fat tissue cultured in vitro

图2 脂肪干细胞生长曲线Fig.2 Growth curves of h ADSC

显微镜下ADSC的形态学改变（图3）与生长曲线一致.第6 d细胞达到90%融合，第10 d即出现局部重叠生长.然而第11 d，镜下观察到单层ADSC上有一些卷曲溶解的细胞，接下来的几天，细胞继续重叠生长，形成一个厚的细胞片层.20 d后，细胞片层从孔板边缘卷起，细胞向卷起的空白区伸展增殖，跨过卷起的细胞片层和空白区.当细胞增殖至35 d以上，细胞片层完全卷起，此时通过cck－8检测细胞数量，发现其OD值与20 d左右细胞的OD值无显著性差异.

根据生长曲线计算细胞的群体倍增时间，发现细胞的群体倍增时间随传代次数的增加而增加，从第3代的36 h增加到第25代的96 h（图4）.每代细胞几个对数增殖期的倍增时间没有显著性差异，但第2个对数增殖期倍增时间稍短于其他对数增殖期的倍增时间.

图3 对应于生长曲线不同时刻脂肪干细胞形态学改变Fig.3 Morphology changes of h ADSC in accordance with the growth curves

图4 ADSC倍增时间的检测Fig.4 Doubling time determination for ADSC

原代细胞增殖迅速，2～3 d细胞即达90%融合，随着传代纯化，到第4代细胞得到完全纯化时，ADSC细胞总量约为8×107个.根据细胞倍增时间计算可知每400～600 mg脂肪组织共可收获约5×105个ADSC.

2.3 表面标志物的鉴定

流式细胞仪检测结果发现（表1），第4、20、25代细胞中大多数细胞CD13、CD29、CD44、CD105和CD166阳性表达，而CD34、CD45和 HLA－DR都呈阴性表达.第4代细胞的阳性表达率稍高于第20代.本文还发现每隔14 d传代得到的25代细胞干细胞相关表面标志的表达率要高于常规5 d传代得到的25代细胞的表达率（P＜0.05）.

表1 第4和第20代脂肪干细胞表面CD标志物的表达Tab.1 Expression of cell surface CD markers of ADSCs of passages 4 and 20

2.4 转录因子的表达

第4和20代细胞转录因子Nanog、Oct－4、Sox－2和Rex－1都呈阳性表达，两者的表达率R没有显著性差异.第30代细胞 Nanog、Oct－4、Sox－2和Rex－1 m RNA虽然也呈阳性表达，但表达率明显低于其他两代细胞（P＜0.05）（图5（a）、6（a））.每14 d传代得到的25代细胞Nanog、Oct－4、Sox－2和Rex－1的表达率明显高于每5 d传代得到的25代细胞的表达率（图5（b）、6（b））.

表2 两种传代方法得到的25代细胞表面CD标志的表达Tab.2 Expression of cell surface CD markers of ADSC of passage 25 with two subculture methods

图5 不同代数脂肪干细胞转录因子m RNA的表达情况Fig.5 Transcription factors mRNA expression in h ADSC of different passages

2.5 多向分化潜能

2.5.1 成脂肪潜能 ADSCs经脂肪诱导液向脂肪诱导分化5 d后，胞浆内出现少量脂滴并逐渐聚集.8 d后，细胞形态发生明显改变，从长梭形类成纤维细胞外观逐渐变圆，并且开始出现充满脂滴的细胞.脂肪分化诱导2周后出现了大量的脂滴（图7（a1））.油红“O”染色后细胞内出现大量红染颗粒（图7（a2）、（a3）、（a4）），证明镜下所见细胞内颗粒确为脂滴.另外，从半定量分析结果（图8）可知，第25代细胞成脂肪能力明显弱于第4代细胞.而2个25代细胞的成脂肪潜能没有显著性差异.

图6 RT－PCR结果半定量分析Fig.6 Semiquantitative RT－PCR analysis

2.5.2 成骨潜能ADSCs 成骨诱导后约7 d长满单层，生长略慢.细胞多为梭形，随时间延长，密度增高，细胞呈多层生长，细胞外分泌基质增多.经ALP染色后见第4代细胞具有较强的碱性磷酸酶的活性（图7（b2）），而第25代细胞诱导7 d后碱性磷酸酶的活性明显低于第4代（图7（b3）、7（b4））.14 d时有局灶型点状钙化斑形成，21 d时形成明显的矿化结节沉积，随诱导时间增加，结节状沉积愈加明显，颜色加深.Von Kossa染色显示结节状沉积为黑色（图7（c2）、（c3）、（c4）），证实了结节状沉积为钙盐沉积.同样，第25代细胞形成的钙化结节明显少于第4代细胞.2个25代细胞碱性磷酸酶活性和钙化结节形成都没有显著性差异（图8）.

图7 脂肪干细胞多向分化潜能的检测Fig.7 Multi－differentiation potentials of h ADSCs toward mesodermal and endodermal lineages

2.5.3 成软骨潜能 经软骨诱导液培养后，细胞体积增大，生长相对变慢，细胞由成纤维样变为椭圆形及三角形，有的呈肾形（图7（d1））.诱导培养14 d可见细胞周围有基质分泌.甲苯胺蓝染色后，可见大量异染性基质，呈蓝紫色（图7（d2）、（d3）、（d4）），表现为软骨细胞分化特点（见图4）.2个25代细胞成软骨潜能没有显著性差异，但都明显低于第4代细胞.

2.5.4 成心肌潜能 5－氮胞苷作用24 h，继续培养4周后细胞重叠生长，但并没有发现明显的形态学改变和自发搏动的细胞.荧光染色后显微镜下观察，第4代ADSC少有的几个细胞出现绿色荧光（图7（e2）），而第25代细胞诱导染色后未见绿色荧光（图7（e3）、（e4））.

图8 脂肪干细胞分化率的半定量分析Fig.8 Semiquantitative analysis of differentiation ratio of ADSCs

3 讨 论

用本文改进的分离方法，每500 mg脂肪组织平均可获得5×105个干细胞，比文献报道的细胞获得率[4]高20倍以上.这是因为本文应用胰酶和胶原酶联合消化，可大大缩短消化时间，从而避免了酶对细胞的过度损伤.此外，为排除红细胞的干扰，一般都使用NH4Cl破坏红细胞[5]，而本文是通过换液的方法去除红细胞，2次换液后红细胞基本消失，这样就避免了NH4Cl对细胞的损伤.

本文分离培养的ADSC比前人的具有更强的增殖能力，25 d内出现3个对数增殖期，虽然在每个对数增殖期末有生长停滞现象，镜下可观察到细胞出现接触抑制，有少量细胞死亡，但通过反馈作用细胞又继续分裂增殖，进入另一个增殖高峰.ADSC 如此强的增殖能力是以前报道[6、7]中从未出现过的.

虽然体外长期传代培养后ADSC仍能保持较强的增殖能力，但还是随着传代次数的增加有所下降，表明传代时胰酶的作用会对细胞造成一定的损伤.为减少胰酶的作用次数，本文将培养至20代的细胞分别按常规5 d传代，或14 d传代，传至25代时发现每14 d传代得到的细胞增殖力略高于每5 d传代得到的细胞，并且细胞数量是常规传代的20倍.

本文所培养的ADSC其CD34和CD45都呈阴性表达，HLA－DR作为排除成纤维细胞的表面标志也是持续阴性表达，这可以为ADSC的自体或同种异体移植提供理论依据.同时CD13、CD29、CD44、CD105和CD166都呈阳性表达，与其他研究结果一致[2、8].间充质标志物持续表达说明贴壁的ADSC可以增殖而没有丢失干细胞相关的表面标志物，反映了ADSC向间充质起源细胞系的分化能力，如脂肪、软骨和成骨.

转录因子 Nanog、Oct－4、Sox－2和 Rex－1，特别是Oct－4、Nanog和Sox－2在指导干细胞的多向分化潜能中起着重要的作用[9].本文培养的ADSC传至30代时仍能表达 Oct－4、Nanog、Sox－2和Rex－1 mRNA，而且每隔14 d传代得到的25代细胞的表达率高于每隔5 d传代得到的细胞.因为这4个转录因子启动、维持并调节多能干细胞的分化潜能[10]，因此每隔14 d传代得到的细胞与常规传代的细胞相比具有更强的分化潜能.

4 结 语

本研究方法可以从500 mg人脂肪组织中获得5×105个干细胞，而且所分离的细胞可快速长期持续增殖（3～4 d即可达到95%融合，1个月出现3个对数增殖期）；增殖至25代以上仍能较好保持干细胞表型特征和多向分化潜能；如果每隔14 d传代而非常规5 d传代，可获得更多更高质量的干细胞.因此ADSC相对于MSC是一个更好的干细胞资源，在细胞移植和组织工程中将有很好的应用前景.

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