光皮木瓜多糖的纯化及含量测定

2010-06-04刘继延,刘学清

化学与生物工程 2010年4期

光皮木瓜(Chaenomelessinensis)为蔷薇科光皮木瓜属植物,又名海棠、土木瓜,其形状、功用与木瓜相近,易被误作木瓜使用[1]。光皮木瓜在我国南北均可生长,以湖北、陕西、安徽、浙江等地分布较多。光皮木瓜多糖是光皮木瓜的有效成分之一，不仅有抗炎、抗病菌、抗衰老、抗肿瘤等作用[2], 而且对烧伤导致的伤口溃烂具有独特的疗效，能有效促进伤口的愈合。

准确测定木瓜多糖含量对选择原料、评价提取和纯化工艺非常重要。多糖的检测方法大致可分为两大类:物理方法有高效液相色谱法、气相色谱法和质谱法;化学方法有斐林法、苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法。由于物理方法需昂贵的仪器，其应用受到限制，而化学法简单、快速、无需多糖纯品和精密仪器,因而应用广泛[3,4]。作者曾详细研究了光皮木瓜多糖的提取工艺[5]。在此基础上，用三氯乙酸对热水浸提的光皮木瓜多糖进行精制，去除其蛋白质，并采用苯酚-硫酸法测定了光皮木瓜的多糖含量，对测定条件进行了优化。

1 实验

1.1 材料、试剂和仪器

光皮木瓜于9月份采自陕西省白河县,洗净,在真空烘箱中于60℃连续烘干，用样品粉碎机粉碎至200目过筛,得到光皮木瓜干粉。

葡萄糖(标准品)；硫酸、苯酚、95%(体积分数)乙醇，分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

UV-2401型紫外可见分光光度计，日本岛津；LGJ-18型真空冷冻干燥机，湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 光皮木瓜多糖的提取

称取10 g光皮木瓜粉置索氏提取器中,依次用约90 mL石油醚、乙醚回流提取4 h。残渣挥干溶剂后倒入250 mL三口烧瓶中，继续用水回流，过滤。将滤液倒入烧瓶中经旋转蒸发器浓缩，-18℃冷冻干燥至恒重。热水提取条件为：提取温度90℃、提取时间6 h、液固质量比70∶1。

1.2.2 光皮木瓜多糖的纯化

取光皮木瓜多糖粗提液加入一定体积10%三氯乙酸溶液,静置24 h，4000 r·min-1下离心10 min ,倾去上清液,沉淀干燥后称重。上层清液浓缩至一定体积后,用95%乙醇沉淀，使含醇量达80% ,于冰箱冷藏静置48 h后,滤取沉淀, -18℃冷冻干燥至恒重，得纯化的光皮木瓜多糖。

1.2.3 葡萄糖标准曲线的绘制

5%苯酚试剂的配制：称取12.5 g苯酚，加适量去离子水溶解，移至250 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，置冰箱内备用。

将葡萄糖标准品配成浓度为100.8 μg·mL-1的葡萄糖标准溶液,准确移取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL于10 mL比色管中，分别加水至1.0 mL，然后再分别加入5%苯酚1.5 mL、浓硫酸6.0 mL，摇匀，静置25 min，在波长490 nm处测定吸光度，以1.0 mL蒸馏水作空白，绘制标准曲线并拟合得到回归方程。

1.2.4 换算因子的测定

精确称取干燥恒重的精制光皮木瓜多糖40 mg，加入适量水溶解后转移至100 mL容量瓶中，定容，摇匀，即为多糖储备液。移取储备液0.2 mL，稀释至1 mL，按1.2.3方法测定吸光度，并依式(1)计算换算因子(f)。

(1)

式中：m为多糖质量，μg；c为多糖液中葡萄糖的浓度，μg·mL-1；D为多糖的稀释倍数。本实验中m=40，D=5,计算出换算因子f为0.465。

1.2.5 多糖含量测定

精确称取光皮木瓜粉2.5 g，按照1.2.1方法提取多糖，粗提液定容于100 mL容量瓶中制成样品液，精确吸取样品0.20 mL，稀释至1.0 mL。按1.2.3方法测定吸光度，并依式(2)计算多糖含量。

(2)

式中：c1为样品溶液中葡萄糖浓度，μg·mL-1；D1为样品的稀释倍数;m1为样品的质量，μg。

2 结果与讨论

2.1 粗多糖中蛋白质的去除

以蒸馏水为参比, 在200～340 nm 波长范围内对光皮木瓜粗多糖水溶液进行扫描, 结果见图1。

图1 光皮木瓜多糖UV吸收曲线

从图1可看出，光皮木瓜粗多糖的紫外吸收特征表明样品中既含有多糖(最大吸收在200～210 nm 附近),同时也含有少量的蛋白质(最大吸收在280 nm 附近)。因此,首先需要对粗多糖进行除蛋白质处理。

本研究选用三氯乙酸法去除蛋白质，结果见表1。

表1 多糖溶液在278.6 nm的吸收值与三氯乙酸用量的关系

从表1可知，A值随三氯乙酸用量的增加而减小，在三氯乙酸用量超过0.7 mL后，变化逐渐趋缓。称量沉淀的质量，得到粗多糖中蛋白质含量为1.19%。光皮木瓜多糖去除蛋白质后的UV光谱见图 1。

从图1可看出，采取三氯乙酸法去除光皮木瓜多糖中的蛋白质后，多糖在278.6 nm处的吸收明显削弱。考虑到提纯次数太多会造成多糖损失大，因此本研究依据表1结果，确定采用三氯乙酸提纯3次，每次用量0.7 mL,得到精制的光皮木瓜多糖。

2.2 多糖含量的测定

2.2.1 标准曲线的测定

苯酚-硫酸法测得葡萄糖标准曲线数据见表2。

表2 葡萄糖标准曲线数据

由表2拟合回归方程为y=0.01522x+0.00128，R=0.9881,式中：y为吸光度；x为葡萄糖浓度,μg·mL-1。

2.2.2 显色条件对木瓜多糖含量测定的影响

苯酚-硫酸法测定多糖含量,其原理是根据多糖在硫酸的作用下先水解成单糖分子,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚生成橙黄色化合物,再以UV法测定。在测定多糖含量时,因难以得到相应的多糖对照品,通常以葡萄糖等单糖作为对照,测定结果则以单糖来表示多糖的含量。采用苯酚-硫酸法测多糖含量的关键操作环节是显色。有报道认为,影响显色的重要因素是显色温度、显色时间、苯酚及硫酸的用量。本研究以显色后490 nm 处的吸收值为指标,考察了几个主要因素对缩合反应进行程度的影响，结果见表3～表6。