王鹏伟，史俊华



5-氮胞苷和利福平对丛枝病泡桐幼苗形态和蛋白质变化的协同影响

王鹏伟1，史俊华2

（1.信息工程大学信息工程学院，河南 郑州 450002； 2.河南农业大学泡桐研究所，郑州 450002）

以感染丛枝病的豫杂一号泡桐幼苗为试验材料，通过不同浓度5-氮胞苷和利福平处理，研究了其幼苗形态和蛋白质的变化。结果表明，适宜浓度的利福平和5-氮胞苷共同使用可抑制泡桐丛枝病的发生。150 µmol·L-15-氮胞苷+80 mg·L-1利福平可以抑制豫杂一号泡桐丛枝病症状。存在于健康豫杂一号幼苗中的蛋白质6.8、24ku而在病苗中观察不到。表明该蛋白质可能与豫杂一号泡桐丛枝病发生有一定关系。

泡桐丛枝病；5-氮胞苷；利福平；蛋白质；双向电泳

泡桐是我国重要的速生用材、出口木材和道路绿化树种之一，但是，泡桐丛枝病的广泛性和高发率严重制约和影响了泡桐的生产和发展，国内外学者对泡桐丛枝病的发生机理和防治方法作了大量的研究工作[1~4，5~10，12~16]。研究表明，植原体是泡桐丛枝病发生的病原，植物植原体病害的化学治疗主要采用抗生素治疗。利福平作为细菌等微生物的遗传物质合成抑制剂，对泡桐丛枝病有消除病症的作用[4]，然而，其浓度的选择及和其他物质的共同作用的研究较少，文章探讨不同浓度5-氮胞苷（5-Azacytidine,5-Aza）和利福平（Rifampin）协同处理患丛枝病的豫杂一号泡桐组织培养苗，观察5-氮胞苷、利福平对泡桐丛枝病外部形态发生的影响及对患丛枝病泡桐苗木蛋白质变化的影响，为泡桐丛枝病的有效防治和发生机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所采用的材料为河南农业大学泡桐所林木生物技术实验室保存的豫杂一号患丛枝病组培苗和健康组培苗，保存该组培苗的基本培养基为1/2MS培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 不同浓度5-氮胞苷和利福平对患丛枝病泡桐组织培养苗的形态影响

将在1/2MS培养基上保存的患丛枝病豫杂一号泡桐顶芽，分别接种到附加质量浓度为0，50，100，150，200，250 µmol·L-15-Aza和利福平80，100，120mg·L-1NAA 0，0.3mg·L-1质量浓度组合的MS培养基上，培养基中蔗糖质量浓度为20 g·L-1，琼脂为3.6 g·L-1，每瓶放4个顶芽，每个质量浓度处理组合20瓶。于温度为25℃±2℃的黑暗条件下培养7 d；在光照强度2 500 lx，光照时间16 h·d-1的条件下培养23 d。7 d后，每天观察1次苗木生长情况， 30 d后统计结果，计算生根率、腋芽生长率，植株生根率和腋芽生长率的计算公式为：

叶片上出现刚毛的情况、叶片颜色和节间生长情况，各项观察以肉眼可辨为标准（叶片上刚毛0~60%为较少，60%~80%为中等，80%~100%为较多；叶片大小平均小于0.5 cm2为较小，1 cm2为较大，介于两者之间为中等）。苗木生长30 d以后，将外表呈现健康的组织培养苗剪取顶芽转入1/2MS培养基中进行培养；并将经过不同质量浓度组合处理过的组织培养苗在低温下提取出来，用液氮浸泡1~2 min，保存在-70℃冰箱中，备用。

1.2.2 蛋白质双向电泳

叶片蛋白质干粉及蛋白质样品的制备和蛋白质双向电泳采用范国强等[2，3]试验方法进行。

2 结果与分析

2.1 5-氮胞苷、利福平对豫杂一号泡桐丛枝病幼苗形态变化的影响

从5-氮胞苷和利福平处理后苗木形态变化结果（图1，表1）可以看出，不同浓度的5-氮胞苷和利福平组合对豫杂一号泡桐丛枝病幼苗的形态变化有很大影响。在利福平浓度相同的条件下，5-氮胞苷对丛枝病的好转有一定的作用，并且过高或者过低浓度的5-氮胞苷都不利于症状的减轻或者消除；在利福平质量浓度为80 mg·L-1的条件下，5-Aza浓度在0～50 µmol·L-1时，随着5-Aza浓度的增高，患病幼苗长出第1条根所需时间逐渐变长，幼苗生根数量逐渐减少，腋芽生长率降低，但是腋芽长出时间没有变，叶片均大且均有刚毛； 5-Aza浓度为100～200µmol·L-1时，幼芽生根显著受到抑制，生根时间推迟明显，幼苗生长过程中没有丛生腋芽产生，顶芽不再膨大，幼苗叶片大小、叶片颜色、叶片上刚毛的数量没有明显区别；当5-Aza浓度为250µmol·L-1时，幼苗在第26天又有腋芽长出，腋芽生长率为5%。这些结果表明，在利福平浓度相同的条件下，加入适宜浓度的5-Aza对患丛枝病泡桐体内植原体的生长和繁殖有一定的抑制作用，其抑制作用大于单一使用利福平；较高或者较低浓度的5-氮胞苷都不利于丛枝病症状的减轻。150 µmol·L-1和200µmol·L-1这2个浓度的5-氮胞苷对于丛枝病症状的减轻较为明显。并且5-氮胞苷对豫杂一号患丛枝病幼苗的生根具有抑制作用，随着5-氮胞苷浓度的升高，生根时间依次延迟。当利福平质量浓度达到100 mg·L-1的时候开始，不管5-氮胞苷的质量浓度如何，MS上的腋芽生长率都为0，在30天的培养期间均未见腋芽的产生，也没有顶端膨大现象，并且所有组合的幼苗都密被刚毛，幼苗的茎干都很健壮。但是在生长到大约24天时，各组合的幼苗的叶片开始有枯黄或者脱落的现象，当利福平质量浓度达到120 mg·L-1的时候这种现象更加严重，而在1/2MS培养基上维持健康的时间最长，从利福平100 mg·L-1的40～57 d增加为70～72 d。说明利福平在抑制泡桐丛枝病方面作用大于5-氮胞苷，同时高浓度的利福平对泡桐生长的副作用也比较明显。

图1 豫杂一号泡桐丛枝病幼苗的形态变化

A.病苗；B. 200µmol·L-15-氮胞苷； C. 150 µmol·L-15-氮胞苷+80 mg·L-1利福平+0.9 mg·L-1NAA； D.健康苗（80利福平+50 µmol·L-15-Aza，80利福平+100 µmol·L-15-Aza， 100利福平+50 µmol·L-15-Aza，120利福平+50 µmol·L-15-Aza）

另一方面，在5-氮胞苷质量浓度一定时，利福平的质量浓度对泡桐丛枝病的减轻或者消除起着决定性的作用。当5-氮胞苷浓度为50 µmol· L-1时，利福平质量浓度为80 mg·L-1的条件下，第24天时培养基中有腋芽出现；利福平质量浓度为100 mg·L-1的条件下，幼苗生长过程中没有丛生腋芽产生，维持健康的时间从MS基上的24天提高到了40天；利福平质量浓度为120 mg·L-1的条件下，培养基中没有腋芽出现，维持健康状态的时间提高到了70天；当5-氮胞苷质量浓度为100～200 µmol·L-1时，培养基中没有腋芽出现，这些组合全都呈现健康，随着利福平质量浓度的增加，维持健康的时间从MS基上的26天提高到了72天，但是幼苗的叶片开始有枯黄或者脱落的现象，组合间在形态上差异不明显；当5-氮胞苷质量浓度为250 µmol·L-1时，利福平质量浓度为80 mg·L-1的条件下，第26天时培养基中又有腋芽出现；利福平质量浓度为100~120 mg·L-1的条件下，幼苗生长过程中没有丛生腋芽产生，维持健康的时间依次提高。以上结果说明，利福平和5-氮胞苷在对植原体的抑制或消除上具有相互加强或是增强抑制作用的效果；利福平和5-氮胞苷浓度的最佳组合不是浓度越高越好。

表1 不同浓度5-氮胞苷、利福平处理后苗木形态变化

注： -表示没有发病，*表示由于在处理时已经发病，因此没有在1/2MS培养基上接转。

由以上分析可知，150 µmol·L-15-氮胞苷+80 mg·L-1利福平这种质量浓度组合是治疗泡桐丛枝病的最佳组合。

2.2 5-氮胞苷和利福平处理对丛枝病幼苗蛋白质的影响

由5-氮胞苷和利福平对患丛枝病幼苗蛋白质的双向电泳结果（图2）可以看出，不同浓度的5-氮胞苷利福平组合处理后，病苗叶片蛋白质发生了较为明显的变化。存在于健康豫杂一号幼苗中的蛋白质6.8、24ku而在病苗中观察不到[3，4]，我们在双向电泳图谱中（图2：A～I）也发现了同样的现象。5-氮胞苷0+利福平80 mg·L-1这一质量浓度组合处理的病苗其形态呈现丛枝病症状，在其叶片蛋白质的双向电泳图谱中（图2：H）观察不到6.8、24ku蛋白质；5-氮胞苷100 µmol·L-1+利福平80 mg·L-1这一质量浓度组合处理的病苗其形态呈现无丛枝病症状，在其叶片蛋白质的双向电泳图谱中（图2：B）出现了6.8、24ku蛋白质；在其他的质量浓度组合中，病苗形态呈现无丛枝病症（表1），其幼苗叶片内均出现了该蛋白质（图2： C、D、E、F、G）。此外，未处理患病幼苗叶片内也没有该蛋白质的存在（图2：A ），而在健康幼苗叶片内存在该蛋白质（图2：I）。这表明一定质量浓度的5-氮胞苷和利福平协同处理患病苗可诱导体内6.8、24ku蛋白质的重现。从而推测一定质量浓度的5-氮胞苷和利福平协同处理可能清除患病幼苗体内存在的植原体，使由于植原体干扰而导致降低或停滞合成该蛋白质的基因重新激活，幼苗不呈现丛枝病症状[4]。

3 结论与讨论

抗生素具有在极小的浓度下有选择地抑制、促进或杀灭其他微生物和生物细胞的作用。利福平就是1种能够抑制RNA的转录的抗生素。适宜浓度的利福平和5-氮胞苷共同使用可抑制泡桐丛枝病的发生。浓度为100 mg·L-1、120 mg·L-1的利福平对泡桐丛枝病的抑制具有明显的效果，但造成苗木叶片枯黄或脱落。培养基中加入5-氮胞苷可以降低利福平的使用浓度。150 µmol·L-15-氮胞苷+80 mg·L-1利福平可以抑制豫杂一号泡桐丛枝病症状。范国强等（2006，2007）的研究结果表明抗生素可诱导病苗体内6.8、24ku蛋白质的重现。本试验的一些研究结果也表明一定质量浓度的5-氮胞苷和利福平协同处理患病苗可诱导体内6.8、24ku蛋白质的重现，可以消除病苗丛枝病的发生。存在于健康豫杂一号幼苗中的蛋白质6.8、24ku而在病苗中观察不到。表明该蛋白质可能与豫杂一号泡桐丛枝病发生有一定关系。

图2 5-氮胞苷和利福平处理后病苗叶片蛋白质的双向电泳图谱

A 病苗；B 5-氮胞苷100 µmol·L-1+利福平80 mg·L-1；C 5-氮胞苷200 µmol·L-1+利福平 80 mg·L-1； D 5-氮胞苷100 µmol·L-1+利福平100 mg·L-1；E 5-氮胞苷200 µmol·L-1+利福平 100 mg·L-1； F 5-氮胞苷100 µmol·L-1+利福平120 mg·L-1；G 5-氮胞苷200 µmol·L-1+利福平 120 mg·L-1H 5-氮胞苷0+利福平80 mg·L-1；I 健康

甲基化是活体细胞中1种最常见的DNA共价修饰形式，它对于控制基因表达、DNA复制及系统发育以及生物自身的保护、抵御外来基因组的干扰起着十分重要的作用。具体经过5-氮胞苷处理后的苗木的总甲基化水平、以及甲基化位点是否变化，还有待于做进一步的研究。

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Effects of 5-Aza and Other Extraneous Substances on the Changes of Morphology and Protein ofSeedlings with witche’s Broom

WANGPeng-wei1，SHI Jun-hua2

（1.Information engineering university,Zhengzhou 450002, China; 2.Henan agricultural universityresearch institute,Zhengzhou 450002,China）

The paper take the seedlings ofinfected witche’s broom as the experiment material .Reaserch on the effect on the morphological and the preotin change that treated by different concentration of 5-Aza and rifampin. The main results are as following: Appropriate concentration of 5- Aza and rifampin can restrainwitche’s broom. Treament of 150 µmol·L-15- Aza+80 mg·L-1rifampin can restrainwitche’s broom. The protein (6.8、24ku) exist in the healthy seedlings can not be observed in the seedlings of witche’s broom. This indicate that the protein possibly has some realationship withwitche’s broom.

witche’s broom; 5-Azacytidine ; Rifampin ; Protein ; 2- D electrophoresis

S 763.1

A

1003-2630（2010）03-0004

2010-08-15

（责任编辑：王文彬）