王 静，陈随清，王延丽，董诚明，冯卫生（河南中医学院，郑州市 450008）

山茱萸是山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.除去果核的干燥成熟果肉[1]，主产于我国河南、浙江、陕西等省，四川、安徽、山东省区亦有栽培[2]。其具有补益肝肾、涩精虚脱的功效，用于治疗眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴等证。山茱萸为河南省道地药材，同时作为常用中成药（如六味地黄丸等）原料，在中药生产及中医临床用量都很大，因此山茱萸药材及其制剂的鉴别一直是研究者热议的话题。有学者分别就其脂溶性和水溶性成分进行过指纹图谱研究[3，4]，但因成分种类多，指纹图谱比较复杂，难以解决药材及其制剂鉴别的问题。本试验利用山茱萸脂溶性成分高效液相色谱（HPLC）中熊果酸和齐墩果酸2个峰不易分离，但容易与其它成分分离的特点，通过熊果酸和齐墩果酸2个成分的三级质谱（MS）图，达到鉴别山茱萸药材的目的；同时对含山茱萸的制剂——地黄丸系列进行了三级MS的分析，旨在为山茱萸药材及其制剂的鉴别与质量评价提供一定的依据。

1 材料

1.1 仪器

HPLC系统，包括真空脱气机、低压梯度混合四元泵、自动进样器、PDA检测器（美国Finnigen公司）；LCQ-Advantage MAX（离子阱）MS检测系统（美国Finnigen公司）；HP-01型无油压力真空泵（上海精科实业有限公司）；BS2242S型分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；SHZ-95B型循环水式多用真空泵（河南巩义市英峪予化仪器厂）；RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣仪器厂）；SZ-93型自动双重水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试药

熊果酸（批号：110742-200516）、齐墩果酸（批号：110709-200304）对照品由中国药品生物制品检定所提供；10批山茱萸药材购于郑州市药材公司，经笔者鉴定为真品；六味地黄丸（批号：080671）、知柏地黄丸（批号：080503）、桂附地黄丸（批号：080103）、明目地黄丸（批号：071202）均由河南宛西制药股份有限公司生产；甲醇为色谱纯，水为双蒸水，醋酸铵及乙酸乙酯均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

2.1.1 山茱萸药材供试品溶液 精密称取山茱萸药材粉末（过3号筛）2.00 g，置于索氏提取器中，加乙酸乙酯100 mL，90℃索氏提取4 h。提取液用旋转蒸发仪于30℃蒸干，加甲醇定容至10 mL，备用。

2.1.2 地黄丸系列供试品溶液 根据每个组方中山茱萸用量的比例，使山茱萸的量达到2.00 g，称取相应的丸剂粉末，加乙酸乙酯100 mL，90℃索氏提取4 h。提取液用旋转蒸发仪于30℃蒸干，加甲醇定容到10 mL，备用。

2.2 对照品溶液的制备

2.2.1 熊果酸对照品溶液 精密称取熊果酸对照品0.00083 g，用甲醇定容至5 mL容量瓶中，备用（熊果酸浓度为0.166 mg·mL-1）。

2.2.2 齐墩果酸对照品溶液 精密称取齐墩果酸对照品0.00096 g，用甲醇定容至5 mL容量瓶中，备用（齐墩果酸浓度为0.192 mg·mL-1）。

2.3 试验条件

2.3.1 HPLC条件 色谱柱：Hypersil ODS C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流动相：甲醇-10 mmol·L-1醋酸铵溶液（84∶16）；流速：0.2 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：210 nm；进样量：5 μL。

2.3.2 MS条件 离子源：ESI，负离子扫描模式；鞘气流速：1.5 L·min-1；辅气流速：0.45 L·min-1；喷雾电压：4.5 kV；高温毛细管温度：350℃；扫描范围：110～600 amu。

2.4 结果

2.4.1 熊果酸和齐墩果酸对照品的三级MS图 将浓度为10.24 μg·mL-1的熊果酸和10.375 μg·mL-1的齐墩果酸对照品溶液混合在一起进MS，得三级MS的主要碎片峰为m/z 377±1，391±1，408。齐墩果酸和熊果酸对照品混合后的三级MS图见图1。

图1 齐墩果酸和熊果酸对照品混合后的三级MS图Fig1 Three-level mass spectrometry of ursolic acid mixed with oleanolic acid

2.4.2 山茱萸药材及地黄丸系列的HPLC图 色谱见图2。

图2 高效液相色谱A.山茱萸药材；B.六味地黄丸；C.知柏地黄丸；D.桂附地黄丸；E.明目地黄丸Fig 2 HPLC chromatogramA.C.officinalis；B.Liuwei dihuang pill；C.Zhibo dihuang pill；D.Guifu dihuang pill；E.Mingmu dihuang pill

2.4.3 山茱萸药材的三级MS图 10批山茱萸药材的三级MS图见图3。

图3 10批山茱萸药材的三级MS图（主要碎片峰为m/z 377±1，391±1，408）A～J.10批山茱萸药材Fig 3 Three-level mass spectrometry for 10 batches of C.officinalis（the main fragment peak are m/z 377±1，391±1，408）A～J.10 batches of C.officinalis

2.4.4 含山茱萸的制剂的三级MS图 含山茱萸的制剂的三级MS图见图4。

图4 含山茱萸的制剂的三级MS图（主要碎片峰为m/z 377±1，391±1，408）A.六味地黄丸；B.知柏地黄丸；C.桂附地黄丸；D.明目地黄丸Fig 4 Three-level mass spectrometry of C.officinalis preparation（the main fragment peak are m/z 377±1，391±1，408）A.Liuwei dihuang pill；B.Zhibai dihuang pill；C.Guifu dihuang pill；D.Mingmu dihuang pill

3 讨论

液-质（LC-MS）联用技术是以HPLC为分离手段，以MS为鉴定方法的分析方法。与传统检测器相比，MS检测器具有更丰富的信息，目前已得到越来越多的应用[5，6]。而LC-MS法已经发展成为对复杂混合成分，尤其是非挥发性、极性和热不稳定性化合物进行高灵敏度定性、定量分析的常规手段。尽管如此，它仍受很多因素的限制。

本试验所采用的是Finnigen电喷雾离子阱多级MS仪，离子源为ESI。ESI源要求流动相所添加的缓冲盐pH调节剂应为挥发性，而HPLC常用的磷酸盐、硼酸盐等缓冲体系不能用于MS，应选用具挥发性的乙酸、甲酸、氨水、醋酸铵等替代。经过摸索，本试验采用醋酸铵为缓冲盐；并且，按照MS要求，缓冲盐的浓度未超过10 mmol·L-1。熊果酸和齐墩果酸为同分异构体，在众多条件的限制下很难达到基线分离（如图2所示），所以选择将熊果酸和齐墩果酸同时进行MS分析。而且，熊果酸和齐墩果酸为酸性物质，采用负离子扫描方式[7]在其通过色谱柱分离时，其在高压状态下与缓冲盐醋酸铵发生络合，减少了熊果酸和齐墩果酸的浓度，使离子化效率不太理想，故加大了进MS的熊果酸和齐墩果酸的浓度。

在上述试验条件下，将熊果酸和齐墩果酸对照品混合溶液进MS，得三级MS的主要碎片峰为m/z 377±1，391±1，408。又对10批山茱萸药材作三级MS分析，得主要碎片峰为m/z 377±1，391±1，408。再对含山茱萸的制剂进行三级MS测定，其中六味地黄丸和知柏地黄丸在上述色谱条件下，熊果酸和齐墩果酸与其它峰都有较好的分离度；桂附地黄丸和明目地黄丸中由于成分的相互作用致使其它峰与熊果酸和齐墩果酸的峰相互堆积，但可通过工作站设置对熊果酸和齐墩果酸的m-1峰m/z 456直接做三级MS，得其主要碎片峰为m/z 377±1，391±1，408，与山茱萸药材的主要碎片峰相同。结果表明，本方法可以用于山茱萸药材及其制剂的鉴别。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：19.

[2]陈随清，董诚明，章运典，等.山茱萸栽培品种的调查[J].中药材，2002，25（5）：305.

[3]韩志慧，赵玉丛，孟 腾，等.山茱萸脂溶性成分的高效液相色谱法指纹图谱分析[J].郑州大学学报（医学版），2006，41（3）：476.

[4]何 娟，王学斌，卢 奎，等.山茱萸高效液相色谱指纹图谱的研究[J].河南工业大学学报（自然科学版），2006，27（4）：32.

[5]王璐璐，方 芸，葛卫红，等.LC-MS法测定人血浆中盐酸伪麻黄碱的浓度[J].中国药房，2007，18（32）：2510.

[6]金 辉，杨耀芳.LC-MS联用法测定人血浆中硫辛酸的浓度[J].中国药房，2007，18（35）：2755.

[7]赵新峰，孙毓庆.高效液相色谱-电喷雾-质谱法分析山茱萸中的化学成分[J].中草药，2008，39（2）：180.