李最琼（南华大学附属南华医院，衡阳市 421002）

小檗碱（Ber）又名黄连素，是一种从黄连植物中提取的苯并异喹啉类季铵型生物碱[1]。Ber可作为一种广谱抗菌药物，对多种革兰阴阳菌、真菌、霉菌、病毒、原虫和线虫等具有抑制杀灭的作用，已在临床上应用多年，常用于治疗感染性分泌性腹泄、消化性溃疡及胃炎、霉菌感染和慢性胆囊炎等，其疗效确切，但作用机制还不明确[2]。Toll样受体2（TLR2）属于模式识别受体，能识别多种病原微生物的成分，如革兰阴性和阳性菌的肽聚糖、真菌的酵母聚糖、原虫的黏蛋白和病毒的包膜糖蛋白等[3]。因此，以TLR2的细菌脂蛋白（BLP）刺激RAW264.7细胞，研究小檗碱对TLR2信号通路和炎症因子表达情况的影响，不但完善了小檗碱抗菌消炎的机制，而且可为扩大其临床应用范围提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

680型酶标仪、PowerPac Basic电泳仪（美国Bio-Rad公司）；IX70型倒置显微镜（日本Olympus公司）；2300型CO2细胞培养箱（美国Sheldon公司）；SW-CJ-IF型洁净工作台（苏州净化设备厂）；Megafuge 1.0R型低温离心机（德国Herculeus公司）；DNA/RNA测定仪（英国Pharmarcia公司）；GBox-HR DNA/蛋白质凝胶成像系统（英国Syngene公司）。

1.2 试药

BLP（采用人工合成的细菌脂蛋白Pam3CSK4·3HCl，美国Alexis公司，批号：ALX-165-066-M002）；盐酸小檗碱（美国Sigma公司，批号：D046）；抗β肌动蛋白单克隆抗体（Anti-beta-actin mAb）、抗核因子κB 抑制性蛋白（IκB）磷酸化抗体、羊抗鼠IgG、酶联免疫吸附法（ELISA）干扰素-γ（IFN-γ）、干扰素-α（TNF-α）、白介素-10（IL-10）、白介素-13（IL-13）试剂盒（美国R&D公司）；Trizol试剂、DNA marker、预染蛋白marker（美国 Invitrogen公司）；TLR2、β-actin引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；RT-PCR试剂盒（美国Fermentas公司）；Premix Taq（大连宝生物工程有限公司）；DMEM培养基低糖（干粉）、胎牛血清（美国Gibco-BRL公司）；其余试剂均为国产分析纯。

1.3 细胞

RAW264.7细胞系购自中国典型培养物保藏中心。

2 方法

2.1 细胞培养

RAW264.7细胞用DMEM培养基培养至对数生长期，用含0.25%胰酶消化，20℃下125 r·min-1离心5 min，收集细胞，调整细胞密度为每1 L含4×108个，并接种于24孔细胞培养板，每孔定容1 mL，于37℃下5%CO2培养箱培养。

2.2 分组和处理

实验分为3组，即对照、BLP、Ber（100 mol·L-1）+BLP组。对照组加 10 μL PBS；BLP 组加 10 μL BLP（终浓度 1 μg·mL-1）；Ber（100 μmol·L-1）+BLP 组先加 10 μL Ber（终浓度 100 μmol·L-1），孵育2 h后再加10 μL BLP（终浓度1 μg·mL-1），每一组均培养至6、12、24、48 h后收集细胞。

2.3 RT-PCR法检测TLR2 mRNA表达

于对应的时间点（6、12、24、48 h）收集细胞，以Trizol试剂抽提RNA。测定RNA浓度后，取2 μg总RNA，按照试剂盒说明书加试剂，在20 μL体积下，用下列条件：65℃、5 min，65℃、42 min，70℃、5 min进行逆转录反应，接着进行聚合酶链反应。TLR2引物序列为：上游5′-GCGTTACATCTTGG AACTGTCGGA-3′，下游 5′-AGGAAGACCTTGCTGTTCTCTACTGT-3′；β-actin 引物序列为：上游5′-ATCATTGCTCCTCCTGAGCGCA-3′，下 游 5′-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3′。按照说明书加试剂，在20 μL体积下，用下列反应条件：94 ℃、3 min，94 ℃、40 s，55 ℃、40 s，72 ℃、1 min，72℃、10 min，30个循环进行聚合酶链反应。TLR2、β-actin的扩增产物分别为231、109 bp。经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶分析系统对扩增产物条带进行扫描，并以TLR2灰度值/β-actin灰度值作为TLR2 mRNA的半定量值。

2.4 Westren-blot检测IκB的磷酸化水平

于对应的时间点（6、12、24、48 h）收集细胞，PBS 洗2次，裂解液裂解，离心，收集上清液，即细胞总蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）法定量测蛋白浓度，用等量蛋白和蛋白上样缓冲液混合，煮沸，进行十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电泳后转硝酸纤维素膜（NC膜），依次孵抗体，即抗磷酸化IκB抗体和辣根过氧化酶标志的羊抗鼠IgG，发光显影定影后，用Quantity one分析软件计算条带灰度值。

2.5 ELISA检测炎症因子的表达

于对应的时间点（6、12、24、48 h）收集细胞培养上清，按照ELISA试剂盒说明书操作，具体的步骤如下：将50 μL稀释液和50 μL 细胞培养上清分别加入包被有IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-13抗体的96孔板内，封板，室温孵育2 h，吸出上清后将板拍干，洗板4次，再加100μL辣根过氧化酶偶联的抗鼠IFN-γ、TNF－α、IL-10 和IL-13抗体，封板，室温孵育2 h，彻底洗板4次，加入100 μL四甲基联苯胺（TMB）底物，室温避光孵育30 min，加入100 μL终止液终止反应，即刻读取450 nm波长处吸光度。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 Ber对TLR2 mRNA表达的影响

在BLP的刺激下，RAW264.7细胞显著性高表达TLR2，并随着刺激时间的延长而增高，具有时间依赖性；100 mol·L-1Ber在6、12 h促进BLP诱导的RAW264.7细胞表达TLR2，但在24、48 h抑制BLP诱导的RAW264.7细胞表达。Ber对TLR2 mRNA表达的影响见图1。

图1 Ber对TLR2 mRNA表达的影响1.对照组；2.BLP组；3.Ber+BLP组Fig 1 Effect of Ber on TLR2 mRNAexpression1.control group；2.BLP group；3.Ber+BLP group

3.2 Ber对IκB磷酸化水平的影响

在BLP的刺激下，RAW264.7细胞内IκB磷酸化水平显著增高，并具有时间依赖性；100 μmol·L-1Ber在6、12 h 促进BLP诱导的IκB磷酸化，但在24、48 h抑制BLP诱导的IκB磷酸化。Ber对IκB磷酸化水平的影响见图2。

图2 Ber对IκB磷酸化水平的影响1.对照组；2.BLP组；3.Ber+BLP组Fig 2 Effect of Ber on the level of phosphorylation of IκB1.control group；2.BLP group；3.Ber+BLP group

3.3 Ber对炎症因子表达的影响

在BLP的刺激下，RAW264.7细胞显著性高表达IFN-γ和TNF-α（P＜0.01），而100 μmol·L-1Ber在 6、12 h 显著促进IFN-γ和TNF-α表达，但在24、48 h 显著抑制IFN－γ和TNF-α表达（P＜0.01或P＜0.05）；BLP的刺激不能显著增加RAW 264.7细胞表达IL-10 和IL-13，但100 μmol·L-1Ber显著增加BLP刺激的RAW264.7细胞表达IL-10和IL-13（P＜0.01或P＜0.05）。Ber对炎症因子表达的影响见图3。

4 讨论

Toll样受体（TLR）属于模式识别受体，主要识别病原相关分子模式（PAMP），激活相应的信号通路，诱导炎症因子的释放，并激活获得性免疫系统，最终清除侵入的病原微生物。

图3 Ber对炎症因子表达的影响A.IFN-γ；B.TNF-α；C.IL-10；D.IL-13；1.对照组；2.BLP组；3.Ber+BLP组；与对照组比较：＊P＜0.01；与BLP组比较：#P＜0.05，##P＜0.01Fig 3 Effect of Ber on the expression of inflammatory cytokinesA.IFN-γ；B.TNF-α；C.IL-10；D.IL-13；1.control group；2.BLP group；3.Ber+BLP group；vs.control group：＊P＜0.01；vs.BLP group：#P＜0.05，##P＜0.01

TLR2是TLRs家族中表达范围最广、识别病原微生物及其产物种类最多的分子，可以在细菌、病毒、真菌及其他一些病原体感染中发挥天然免疫作用，并通过其胞内信号转导而激活获得性免疫[4]。本研究用Ber作用于BLP刺激的RAW 264.7 细胞，RT-PCR 检测的结果表明，100 μmol·L-1Ber在6 h和12 h能够促进BLP刺激的RAW264.7细胞表达TLR2，但在24 h和48 h反而起到抑制的作用。这暗示着Ber可能具有双向调节的作用。

核因子κB（NF-κB）是细胞内参与多种细胞反应的转录因子，如TLR2信号通路的传导。NF-κB通过与抑制蛋白IκB的结合，以非活性的形式处在胞浆中。当IκB被蛋白激酶磷酸化并降解后，NF-κB释放，转移到细胞核内，并结合于特定的DNA位点，启动相应基因的表达，如各种炎症因子[5]。本研究中100 μmol·L-1Ber在6 h和12 h 促进BLP 诱导的IκB 磷酸化，但在24 h和48 h却抑制BLP诱导的IκB磷酸化。结果表明，100 μmol·L-1Ber在早期（6 h和12 h）能够促进BLP诱导的NF-κB激活，但晚期（24 h和48 h）却起抑制的作用。

炎症因子主要分为促炎细胞因子和抗炎细胞因子。促炎细胞因子主要包括IFN-γ和TNF-α等，其过度升高是过度炎症反应的主要原因；抗炎细胞因子主要包括IL-10和IL-13等。研究表明，感染机体内促炎细胞因子的过度升高，可刺激机体分泌抗炎细胞因子，从而减轻炎症反应，起到负反馈调节的作用[6，7]。本研究ELISA结果表明，100 μmol·L-1Ber在早期能够促进IFN-γ和TNF-α的分泌，而晚期却抑制IFN-γ和TNF-α的分泌，但在后期（12 h、24 h和48 h）显著性促进抗炎因子IL-10和IL-13的分泌。这可能是过度促炎因子的分泌刺激了抗炎因子的表达，或者是Ber能促进抗炎因子的分泌。但BLP的刺激能诱导促炎因子IFN-γ和TNF-α的分泌，却不能诱导抗炎因子IL-10和IL-13的分泌，表明IL-10和IL-13的分泌不是由负反馈调节诱导，而是由Ber促进的。

本研究表明，Ber在BLP刺激的早期，能够促进TLR2的表达、NF-κB的激活和促炎因子IFN-γ和TNF-α的分泌，加强TLR2信号通路的激活，增强TLR2抗病原微生物的作用；但在BLP刺激的晚期，可能是过度炎症反应时期，Ber反而抑制TLR2的表达、NF-κB的激活和促炎因子IFN-γ和TNF-α的分泌，抑制TLR2信号通路的激活，抑制过度炎症反应。并且，Ber具有促进抗炎因子的分泌从而能抗菌消炎的作用，但其具体机制有待进一步的研究。

[1]叶宝娜，郝满良，刘 萍，等.小檗碱的抗炎作用机制[J].中国兽医杂志，2008，44（3）：85.

[2]郑洪艳，徐为人.小檗碱药理作用研究进展[J].中草药，2004，35（6）：708.

[3]Trine H，Mogensen.Pathogen recognition and inflammatory signaling in innate immune defenses[J].Clinical Microbiolgy，2009，22（2）：2240.

[4]杨芳芳，陈成水.Toll样受体2的研究进展[J].医学综述，2008，14（11）：1636.

[5]欧和生，廖端芳，唐朝枢.蛋白磷酸化对胞核因子κB活化的调节[J].中国动脉硬化杂志，1999，7（1）：80.

[6]于永洲，王占科，潘小清.可溶性白细胞分化抗原14对严重烫伤内毒素血症小鼠血清促炎和抗炎细胞因子的影响[J].中国药房，2009，20（4）：250.

[7]de Mello LM，Bechara MI，Solé D，et al.TH1/TH2 balance in concomitant immediate and delayed-type hypersensitivity diseases[J].Immunol Lett，2009，124（2）：88.