杜晓宁,宋明鸣,赵 诚,徐建飞

(上海化工研究院,上海 200062)

13C-尿素是重要的13C标记基础试剂之一,其最为广泛的应用是临床诊断用13C-尿素呼气试验(13C-UBT)[1-2]。目前13C-UBT在临床上用于检测胃幽门螺旋杆菌(Helicobacter Pylori,HP)感染在国际上已被公认为胃部 HP感染诊断的最重要手段之一,并被誉为胃部 HP感染诊断的金标准。近十几年来,医学领域在以最小剂量的13C-尿素获得高敏感性检测方面做了大量工作,有文献认为最小剂量为25 mg[3];另有文献认为,用中等丰度的13C-尿素可以缩短试剂制备周期,降低生产成本[4]。在分析检测方面,研究13C同位素比值的测定比较多[5],而高丰度13C-尿素的同位素丰度的检测技术鲜有报道。1996年Tetsuya Tamgawa[6]用HPLC-APCIMS检测13C-尿素的丰度取得进展;2004年刘东阳等针对国内尚无13C-尿素的同位素丰度定量检测方法,研究了用LC-MS检测13C-尿素同位素丰度的方法,探索了13C-UBT诊断试剂13C-尿素的定量依据;高效液相色谱法测定呼气试剂盒中13C-尿素的含量及质谱法测定13C-尿素的同位素丰度[7-8]都是为了更好地控制呼气试剂中13C同位素的有效含量,以保证13C-UBT的高灵敏度和特异性。因此,为了更好地开展13C-UBT试验,有必要建立一个能够对高丰度13C-尿素的同位素丰度准确定量的方法。

本工作拟选择合适的样品转化处理方法和实验条件将13C-尿素样品转化为13CO2,以13CO2气体为样品,用气体同位素质谱计分析13C-尿素的同位素丰度。与其它类型质谱分析方法不同,气体同位素质谱采用成分简单且纯度较高的气体为样品气,避免了进样成分为尿素或其衍生物而引进N、H等元素的同位素干扰,具有准确度好、精确度高的特点。

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

MA T-271气体同位素质谱计:美国 Finnigan质谱公司;高温电阻炉(又名马弗炉):上海实验仪器厂;玻璃真空系统:自制,真空度1×10-2Pa;13C-尿素:美国 CIL公司,同位素丰度99.1%),13C-尿素:上海化工研究院,同位素丰度97.5%±0.1%,90.7%±0.1%;亚硝酸钠(分析纯)和氧化铜(化学纯)均为国产试剂。

1.2 实验方法

13C-尿素样品经过转化处理生成13CO2气体,将生成的13CO2气体送入气体同位素质谱计检测系统,用质谱法测定其13C丰度。

1.2.1 样品转化原理

样品转化有2种方法,一种为氧化法,一种为高温灼烧法。

氧化法转化是亚硝酸盐与尿素在酸性条件下反应,其化学反应式[9]如下:

高温灼烧法是以真空样品管内的氧化铜作为供氧剂,尿素在高温下发生氧化反应,其化学反应式如下:

1.2.2 样品制备方法

氧化法:称取2～3 mg13C-尿素样品和2～3 mg亚硝酸钠试剂,使其质量比约为1∶1。将样品和试剂放入专用双球反应管[10]的直管底部,再在双球反应管的支管中加入1～2 mL 6 mol/L的硫酸溶液,用进样连接器接入样品转化真空系统,并抽真空,至溶液中溶解的空气被除去(用手触摸反应管的球泡部明显感觉温度降低),此时可将进样连接器的旋塞阀关闭。将反应管及进样连接器从真空系统取下,把反应支管球泡里的硫酸溶液倾斜倒入盛放固体样品和试剂的球泡,使两球泡中的液固体接触进行反应,用约60℃的热水加热反应管,并不停晃动以使反应进行完全。产生的13CO2气即可作为测定13C丰度的样品气。

高温灼烧法:称取1～1.2 mg13C-尿素样品,10～15 mg氧化铜,少量新鲜铜丝,放入玻璃样品管[11],接入真空系统抽除空气,与此同时用煤气喷灯烘烤样品管壁去除吸附的气体,至真空度低于1×10-2Pa时熔烧取下样品管。将制备好的样品管放入马弗炉,530℃灼烧3 h,自然降温至200℃以下,取出待用。

1.2.3 仪器条件

MA T271气体同位素质谱计工作条件:离子源发射电流为 0.040 mA,电子能量为98.60 eV,阱电压为133.15 V;离子源温度为160℃;高压为10 k V;接收器为法拉弟筒。

1.2.4 样品测定

氧化法:把制得的样品气经过液氮冷冻并接入质谱计真空系统抽真空,除去样品气中含有的氮气,关闭进样连接器的旋塞阀,用冷水将球泡化冻,再将球泡浸入用酒精液氮调制的-50～-60℃冷冻液中数分钟。检测条件:在质谱计的真空度低于2×10-5Pa时将球泡中的13CO2气体引入质谱计进样系统,储样系统压力约为10 Pa。

高温灼烧法:将样品管接入质谱计真空进样系统,待仪器具备检测条件时,将样品管的毛细管部分破碎,待测气体被引入质谱计的进样系统,至储样系统压力约为10 Pa。

2 结果与讨论

2.1 氧化法

2.1.1 硫酸溶液浓度

在尿素转化生成CO2的反应中,氧化剂是亚硝酸。考虑到亚硝酸极不稳定,采取在反应体系内用酸与亚硝酸盐作用生成亚硝酸再与尿素反应生成CO2的方法。在本实验中选用的是对系统干扰较小的硫酸,并比较了不同硫酸浓度对反应的影响,结果列于表1。由表1可知,硫酸的浓度为2.25、4.50和9.0 mol/L都可以满足反应的要求,但在实验中如果酸浓度较低,会延长反应时间,掌握不好会因为反应不完全而造成数据偏差较大;硫酸浓度大于9.00 mol/L时,液体粘度增大,易粘附在反应管壁造成浪费,所以实际操作时可选择酸的浓度比表3中的浓度略大一些,更有利于反应较快完成。

表1 不同硫酸浓度下生成的CO2气体的13 C丰度(s,n=6)

表1 不同硫酸浓度下生成的CO2气体的13 C丰度(s,n=6)

硫酸浓度/mol·L-1 13C丰度/%9.00 99.07±0.06 4.50 99.05±0.07 2.25 99.04±0.15

2.1.213C-尿素最小样品量的确定

13C-尿素价格不菲,所以,在研究检测方法时以最小的样品量制备得到足够供质谱分析的气体并得到可信度高的分析结果是实验的目的之一。为此,安排了两组实验,结果分别列于表2和表3。

由表2可知,样品用量2～5 mg都可以满足样品转化的要求。对这组数据的精密度做统计检验可得 f=3.062 5,置信水平α=0.05时,F(0.05)(4,4)=6.39。此数据表明,表2中不同样品量所测结果没有显著差异。

表2 最低样品量实验,n=5)

表2 最低样品量实验,n=5)

样品量/mg 13C丰度/%2 97.51±0.05 3 97.52±0.05 4 97.51±0.04 5 97.51±0.07

为了考察2～3 mg样品量在仪器检测时随机进样的线性范围,以及检测结果的准确度,进行了不同进样量与特征峰积分强度的相关性实验。具体操作:称5 mg样品,用亚硝酸氧化法处理,将样品转化系统接入质谱进样系统,控制气体进样量(以仪器储样球的压力表示),连续分别进样,检测进样压力为9～20 Pa的结果,数据列于表3。

表3 不同进样量与峰积分强度的相关系数

对表3的两组数据进行线性回归,结果示于图1和图2。由图1和图2可知,仪器进样压力为9～20 Pa时,气体进样量与 m/z=44峰强的相关方程为 y=2.212x+0.465,r=0.997 1,与m/z=45峰强的相关方程为 y=245.41 x+34.223,r=0.999 9。

由表3可知5 mg样品产生的气体在仪器储样球内的压力大于50 Pa,进样量为9 Pa即可得到满意的检测结果。由此,不仅可以确定最小样品消耗量为2 mg,而且,每次转化得到的样品气在控制进气量的条件下,可以满足两次以上重复进样。从表3的检测结果还可以看出,同次转化的样品,分别多次进样得到的数据重复性很好,同时也表明检测样品时仪器的稳定性很好。

图1 进样压力与 m/z=44峰的相关性

图2 进样压力与 m/z=45峰的相关性

2.1.3 重复性实验

用丰度为90.7%的13C-尿素样品进行样品转化和仪器检测的重复性实验,结果列于表4。由表4可以看出,样品转化方法的重复性较好,仪器检测的重复性也令人满意。实验表明,样品转化的反应速度较快,但要保证其完全反应还需要有一定的反应时间,一般控制反应时间1～2 min,样品管内无黄色气体,液体没有反应气泡产生即可进行质谱检测。

表4 样品转化和仪器检测的重复性

2.2 高温灼烧法

含碳有机物在高温下分解生成的CO2是质谱检测同位素丰度的可用气体,寻求最适合的温度、反应时间、反应所需氧的量和处理方法等是非常必要的。

2.2.1 温度条件试验

用丰度为99.1%的13C-尿素样品进行样品转化的温度实验,结果列于表5。由表5数据可以看出,用高温灼烧法转化样品,530～950℃的转化温度下,反应效果没有明显差异。由于在较低温度下反应可以选择普通玻璃制作样品管,也便于烧结,因此选择530℃作后续条件实验。由实验可知:反应时间无需太长,包括升温在内3 h比较合适。

表5 样品转化温度的试验

2.2.2 氧化铜的净化处理

氧化铜试剂在真空制备的样品管中提供氧化反应所需的微量氧气,但是由于微量存在的碱式碳酸铜在高温时也发生分解反应,生成天然丰度的CO2,对检测13C丰度会产生同位素稀释效应,所以,实验过程应考虑对氧化铜试剂进行前处理,用加热灼烧的方法分解氧化铜试剂表面的碱式碳酸铜,即在280～300℃的马弗炉里烘烧2 h后使用。实验中选用了2个不同丰度的13C-尿素样品验证氧化铜净化处理的效果,结果列于表6。由表6可以看出,对氧化铜进行前处理和不进行处理,13C丰度的检测结果有明显差异。处理过的氧化铜,其检测结果也不理想,这是由于使用的氧化铜是用研钵粉碎的,其粒度不够细,因此在530℃反应时颗粒内部的碱式碳酸铜进一步分解仍然对样品检测造成影响。基于此,用同样方法制备空白样品,在检测中扣除氧化铜试剂的影响,由表 6可知,校正后,结果比较理想。

2.2.3 样品与氧化铜的使用量

由表6可知:即使是经过处理的氧化铜在高温灼烧时仍然会生成极少量的CO2,对样品的13C丰度检测产生同位素稀释效应。因此,氧化铜用量的控制也很重要。由实验可知:选用粒径0.1～0.5 mm的氧化铜,并控制其与样品的质量比为10∶1较宜。

表6 氧化铜的条件实验

2.3 计算方法的讨论

CO2气体分子由两种元素构成,其中 C原子有2种稳定性同位素:12C和13C;O原子有3种稳定性同位素:16O、17O、18O。按照排列组合,气体CO2的同位素分子可有12种形式。在13C的同位素丰度大于90%时,CO2分子的主要构成为12C16O16O(m/z=44)、13C16O16O(m/z=45)、12C16O18O(m/z=46)、13C16O18O(m/z=47),m/z为46、47的峰在低分辨质谱检测时会受到其它未知峰的干扰,造成检测结果较大的偏差,而实际上高丰度的13CO2中相对分子质量46、47的分子只有0.04%～0.4%,因此,可以在计算13C同位素丰度时忽略它们,由此带来的偏差小于0.04%,可以满足商品化的13C-尿素的检测要求。所以,在高丰度13C-尿素的同位素丰度计算时,按公式(1)计算既简单又可以避免未知成分的干扰,同时也保证了结果的精准度。

(1)式中,E为13C同位素丰度;V44和V45分别为 m/z为44、45的电信号强度,单位为mV。

3 结 论

用亚硝酸氧化法转化13C-尿素样品为13CO2气体时,2 mg样品即可满足气体同位素质谱的检测要求,检测数据的准确度、精密度都较理想。此方法有操作简单、易于掌握、可以快速得到数据、对真空设备要求低等优点。

高温灼烧法制备质谱检测用13C-尿素样品时,1 mg样品即可满足仪器检测要求,只要严格控制样品与氧化铜试剂的相对量,也能得到令人满意的结果。与亚硝酸氧化法相比,本方法操作比较复杂,对真空设备要求较高,样品检测周期相对较长。但是,此方法在做批量样品转化和检测13C、15N双标记尿素的同位素丰度时有独特的优势。

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