杨 青,武继彪,2,张岫美

(1.山东大学 医学院 药理学研究所,山东 济南 250012;2.山东中医药高等专科学校,山东 莱阳 260062)

随着对脑缺血再灌注损伤后病理生理机制研究的不断深入,近年来与脑缺血有关的炎症反应及其损伤作用日益受到关注。以往研究表明丹皮酚(paeonol)能抑制由缺血再灌注损伤所致的ICAM-1及VCAM-1表达的上调,通过降低黏附分子表达减轻大鼠脑缺血再灌注损伤后的炎症反应而发挥脑保护作用[1]。本研究采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,拟通过观察丹皮酚对脑缺血后脑组织及血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)的影响,进一步探讨其脑保护作用机制,为临床药物开发及应用提供理论依据和实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

丹皮酚注射液(宁波天真制药有限公司,批号H33020043);TNF-α、IL-1β酶联免疫吸附法检测试剂盒,TNF-α、IL-1β免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 动物

健康雄性Wistar大鼠100只,体重220～280 g,SPF级,由山东大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK(鲁)20030004。

1.3 仪器

DDL-5型冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂);318-MC型酶标仪(上海三科仪器有限公司);Leica RM-2235石蜡组织切片机(德国徕卡公司);HL-2BL病理组织漂洗处理仪(上海和利实业有限公司)。

1.4 实验分组及给药

健康雄性Wistar大鼠100只,随机分成5组,即假手术组、模型组、丹皮酚低(15 mg/kg)、中(20 mg/kg)、高(30 mg/kg)给药组,腹腔注射给药,1次/d,连续8 d。假手术组、模型组腹腔注射等容量生理盐水。末次给药后2 h手术造模。

1.5 大鼠局灶性脑缺血模型制备

根据改良的Longa方法制成大脑中动脉闭塞模型。大鼠称重后用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后,仰卧固定于恒温手术台上,作颈部正中皮肤切口,钝性分离各层组织,暴露左侧颈总动脉及分支,在颈总动脉分叉处结扎颈外动脉。结扎颈总动脉近心端,在其上用眼科剪剪一V形小口,并将准备好的线栓从切口插入,线栓进入颈内动脉穿过大脑中动脉起始端至大脑前动脉近端,阻断大脑中动脉的血流。缺血2 h后,将线栓拔出实现再灌注,再灌注时间为22 h。假手术组手术过程同模型组,但不阻塞血管。

1.6 神经行为学评分

大鼠清醒后,观察其行为学变化,按照Zea等的5分法标准,0分:无神经缺损症状;1分:右前肢不能完全伸直;2分:向右侧旋转;3分:向右侧倾倒;4分:不能自己行走或昏迷。

1.7 缺血侧脑组织TNF-α、IL-1β的测定

再灌注22 h大鼠经生理盐水及多聚甲醛液灌流后开颅取缺血侧脑组织,常规固定、脱水、石蜡包埋后,采用视交叉前缘作3 mm厚冠状切片,常规制片(4 μ m厚),采用免疫组化法测定,操作按试剂盒说明书进行。每1只动物取连续切片2张,分别用于测定TNF-α和IL-1β。每1张切片在 40×10倍视野下随机选取梗死周边区不重叠的5个视野,分别计数TNF-α和IL-1β阳性细胞数。

1.8 血清中TNF-α、IL-1β的测定

缺血2 h再灌注22 h后,腹主动脉取血后离心分离出血清,于-20℃冷冻保存,待用。按照ELISA试剂盒测定。

1.9 统计学处理

实验数据用SPSS10.0统计分析软件处理,计量资料以()表示。方差齐时采用单因素方差分析,方差不齐时采用F检验。

2 结 果

2.1 丹皮酚对脑缺血再灌注损伤后大鼠神经行为学评分的影响

模型组大鼠神经行为学评分较假手术组显著增高(P＜0.01),丹皮酚中、高剂量组较模型组大鼠神经行为学评分显著降低(P＜0.01～0.05),其中以丹皮酚高剂量组大鼠的神经行为学评分降低尤为显著,见表1。

2.2 丹皮酚对缺血再灌注大鼠脑组织TNF-α、IL-1β的影响

免疫组化染色阳性结果为胞浆呈棕色颗粒样。假手术组仅偶见TNF-α和IL-1β表达,模型组可见大量胞浆呈棕色的阳性细胞,TNF-α和IL-1β含量明显增高,与假手术组相比有显著性差异(P＜0.01)。与模型组相比,丹皮酚中、高剂量组TNF-α和IL-1β阳性细胞数量明显减少(P＜0.01)。结果见表1和图1～2。

2.3 丹皮酚对缺血再灌注大鼠血清TNF-α、IL-1β的影响

与假手术组比较,模型组血清TNF-α和IL-1β含量明显升高(P＜0.01);与模型组比较,丹皮酚中、高剂量组血清TNF-α和IL-1β含量明显降低,差异有显著性(P＜0.01～0.05)。见表1。

3 讨 论

表1 丹皮酚对脑缺血再灌注大鼠神经行为学评分,脑组织和血清TNF-α、IL-1β的影响(n=10,)Tab.1 Effect of Paeonol on neurological deficit,TNF-α、IL-1β in the brain and serum after MCAO injury in rats(n=10,)

表1 丹皮酚对脑缺血再灌注大鼠神经行为学评分,脑组织和血清TNF-α、IL-1β的影响(n=10,)Tab.1 Effect of Paeonol on neurological deficit,TNF-α、IL-1β in the brain and serum after MCAO injury in rats(n=10,)

与假手术组比较:1P＜0.05,2P＜0.01;与模型组比较:3P＜0.05,4P＜0.01 1P＜0.05,2P＜0.01 vs sham group;3P＜0.05,4P＜0.01 vs model group

组别 剂量/(mg/kg)神经行为学评 分TNF-α阳性细胞数/(cells/mm2)IL-1β阳性细胞数/(cells/mm2)TNF-α/(ng/mL)IL-1β/(ng/mL)假手术组 - 0 7.00±2.09 6.33±1.50 1.41±0.28 0.299±0.053模型组 - 2.50±0.542 40.33±8.352 39.50±7.712 2.83±0.352 0.481±0.0622丹皮酚低剂量组 15 2.16±0.40 34.50±3.50 33.66±3.50 2.64±0.29 0.402±0.071丹皮酚中剂量组 20 1.66±0.513 27.33±2.064 28.16±1.724 1.99±0.224 0.361±0.0703丹皮酚高剂量组 30 1.33±0.514 18.83±3.064 19.00±3.224 1.73±0.194 0.323±0.0514

脑缺血后可导致神经细胞的变性、坏死,功能下降,血流的再灌注一方面对于功能的恢复非常重要,另一方面又会使组织损伤进一步加重,即再灌注损伤。缺血再灌注早期的炎症反应是导致继发性脑损害的重要原因。内皮细胞、神经元和血管周围的炎性细胞被激活,释放炎性细胞因子,这些炎性细胞因子促进了缺血性损伤向炎症性损伤转变。TNF-α、IL-1β为急性脑缺血再灌注损伤中主要的炎性细胞因子[2]。它们作为趋化因子,促使白细胞由血管内向缺血区脑组织迁移,使脑组织损伤加重[3-4]。

TNF-α、IL-1β过表达介导了脑缺血再灌注的炎症反应和一系列与之相关的兴奋性氨基酸神经毒、毒性氧化自由基、酸中毒等反应,这些物质共同作用的后果引起或加重神经细胞坏死或凋亡、脑组织损害[5]。因此,抑制这些炎性细胞因子的释放,拮抗其作用,对于减轻脑组织损伤意义重大。

丹皮酚又称牡丹酚,是从萝摩科植物徐长卿干燥根或全草和毛茛科芍药属植物牡丹的根皮中提取出来的活性成分,临床上主要应用其抗炎作用治疗神经痛、风湿痛及某些变应性疾病[6]。随着对丹皮酚研究的不断深入,其对于脑损伤的保护作用受到广泛关注。丹皮酚能缩小缺血再灌注损伤大鼠的脑梗死体积,降低病理组织损伤,使神经元坏死程度减轻,存活数量增多,间质水肿减轻。对脑缺血再灌注损伤后的脑组织有明确的保护作用[7-8]。

本研究分别测定了脑组织和血清中TNF-α、IL-1β,进行了定性和半定量的分析,从表1可看出,大鼠脑缺血再灌注损伤后,脑组织切片中TNF-α、IL-1β阳性细胞数明显增多,血清中TNF-α、IL-1β水平明显升高。而预先给予丹皮酚可显著降低其水平,改善脑缺血再灌注大鼠神经缺陷症状,并且作用随剂量的增加而更加明显,提示丹皮酚可通过影响炎症因子TNF-α、IL-1β在脑缺血再灌注时的炎症反应过程,减轻脑缺血炎症、改善神经功能而发挥抗脑缺血损伤的作用。

[1]张硕,高海青,张岫美.丹皮酚抑制大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤脑组织细胞间黏附分子-1和血管细胞黏附分子-1的表达[J].中国生化药物杂志,2008,29(1):5-8.

[2]Offner H,Subramanian S,Parker S M,et al.Experimental stroke induces massive,rapid activation of the peripheral immune system[J].J Cereb Blood Flow Metab,2006,26(5):654-665.

[3]Wang X,Baronc F C,Aiyar N V,et al.Interleukin-1 receptor and receptor antagonist gene expression after focal stroke in rats[J].Stroke,1997,28(1):155-161.

[4]Emerich D F,Dean RL 3rd,Bartus R T.The role of leukocytes following cerebral ischemia:pathogenic variable or bystander reaction to emerging infarct[J].Exp Neuol,2002,173(1):168-181.

[5]柳洪胜,张允岭,刘雪梅.从局灶脑缺血再灌注炎症因子的动态变化探讨内毒形成及作用[J].北京中医药大学学报,2007,30(4):246-248.

[6]章灵华,肖培根,黄芝,等.丹皮酚的药理与临床研究进展[J].中国中西医结合杂志,1996,16(3):187-189.

[7]武继彪,隋在云,管华诗.丹皮酚对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].中华中医药学刊,2008,9(26):1887-1888.

[8]孙文芳,高素洁,高金霞,等.丹皮酚对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国临床康复,2004,16(8):3088-3089.