河北省石家庄市第一人民医院 （石家庄 050011）

羊淑平 马小宁 韩 芳△ 李 昌△△ 高 玮△△ 韩 雪△△ 李美锡△△△

消瘀化痰方系经过多年临床筛选出的治疗非酒精性脂肪肝 （NAFLD）的效方,既往药效学实验已证实消瘀化痰方具有显著的调节血脂和抗脂肪肝作用。[1]本研究采用高脂饮食建立 NAFLD模型,观察大鼠血清肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）和白细胞介素 -6（IL-6）的含量变化,探讨消瘀化痰方治疗 NAFLD的作用机制。

1 材料

1.1 动物 健康雄性 SD大鼠 50只,体重 180～200 g,由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供,合格证号:SCXC（鄂）2004-007。

1.2 药物及试剂 消瘀化痰方的组成与制备:消瘀化痰饮由泽泻、丹参、海藻、生黄芪、制半夏、生大黄、郁金、决明子、生山楂、柴胡、炒白术组成,以上药物先用乙醇提取,挥发去酒精,然后将全部药渣加水适量,普通方法煎煮,将提取液与煎煮液混合,浓缩成所需浓度。东宝甘泰片:通化东宝药业股份有限公司出品,批号为H22024764。实验时用 0.5%的羧甲基纤维素钠配制成所需浓度的混悬液。肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）和白细胞介素 -6（IL-6）试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免所。

1.3 主要仪器 FJ-2020型 γ射线免疫计数器（国营 262厂）,MSE-25型高速冷冻离心机 （上海安亭科学仪器厂）,LAUDA-C3型循环恒温水浴箱 （泰克仪器有限公司）。

2 方法

2.1 动物分组与造模 50只健康雄性 SD大鼠,饲养于 18℃～22℃明暗各 12 h的清洁级动物实验室内,正常喂养 1周后,随机分为 5组,即:正常对照组 （简称正常组）、模型对照组 （简称模型组）、消瘀化痰方高、低剂量组 （简称高、低剂量组）、阳性药 （东宝肝泰）对照组 （简称对照组）。动物造模参照文献[2]喂饲高脂饲料,高脂饲料由1.5%胆固醇、0.5%胆盐、10%猪油和 88%基础饲料制成。除正常组喂饲普通饲料外,其余各组均给予高脂饲料,连续 9周。

2.2 给药方法及标本处理 大鼠造模的同时,各组分别给予相应药物灌胃,给药剂量按药理实验方法学计算,消瘀化痰方高、低剂量组分别按43.34 g/kg、21.67 g/kg体重的标准灌服,对照组按 0.9 g/kg体重的标准灌服,正常组和模型组灌服生理盐水。各组 1次/d灌胃,每次用药体积均按 1 mL/100 g计算。实验 9周末,于最后 1次给药禁食 12 h后断头取血,迅速将血样低温离心,分离血清,密封,-20℃冷存待检。在肝脏最大叶距边缘 1 cm处取肝组织 0.5 cm×0.5 cm浸泡于4%多聚甲醛中固定,石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下观察肝组织形态变化。

2.3 指标检测

2.3.1 肝组织形态学观察:取大鼠用 4%的多聚甲醛固定的肝组织,常规石蜡包埋切片,HE染色,光学显微镜观察。

2.3.2 TNF-α和 IL-6的测定:均采用放射免疫法,严格按试剂盒说明书检测。

3 结果

3.1 肝组织形态学改变 光镜下可见:正常组大鼠肝组织结构完整、清晰,肝小叶结构正常,中央静脉大而壁薄,肝细胞排列成肝索,在中央静脉周围呈放射状分布,细胞呈多边形。模型组大鼠肝细胞中度细胞水肿,少量的肝细胞坏死,多数肝细胞内可见大小不等、数量不一的脂滴空泡 （脂肪变性）,重度变性者,脂滴空泡融合,呈现中至重度脂肪变性,但未见明显的纤维化改变。各治疗组动物肝小叶和肝血窦结构清晰,高、低剂量组肝细胞内脂滴空泡基本消失,对照组中少量的肝细胞内仍有脂滴空泡,并有轻度的细胞水肿。

3.2 消瘀化痰方对 NAFLD大鼠血清 TNF-α和IL-6含量的影响 结果显示,模型组大鼠的血清TNF-α和 IL-6的含量较正常组明显升高 （P＜0.01）,经药物治疗后,各用药组血清 TNF-α和 IL-6的含量均低于模型组 （P＜0.05或 P＜0.01）;高、低剂量组大鼠血清 TNF-α和 IL-6的含量均低于对照组 （P＜0.05）,高、低剂量组之间差异无显著性 （P＞0.05）。见表 1。

表1 各组大鼠血清 TNF-α和 IL-6测定结果比较 （±s,n=10）

表1 各组大鼠血清 TNF-α和 IL-6测定结果比较 （±s,n=10）

注:与模型组比较,*P＜0.05,**P＜0.01;与对照组比较,△P＜0.05

组别 TNF-α（ng/m L） IL-6（ng/mL）正 常 组 0.73±0.11** 16.7±2.16**模 型 组 1.41±0.18 22.4±3.92高剂量组 0.82±0.13**△ 17.6±2.85**△低剂量组 0.86±0.15**△ 17.2±2.77**△对 照 组 1.16±0.21* 19.4±3.53*

4 讨论

课题组人员经多年临床观察认为 NAFLD多由饮食失节,恣食肥甘厚味,损伤脾胃,使其运化失常,酿生痰浊,聚集体内,痰阻气滞,肝失调达,血脉瘀阻,痰瘀结于胁下,形成本病。故痰瘀互结、肝脾失调为其主要病机,消痰化瘀、健脾疏肝为其有效治法。因此,精心筛选相关药物组成消瘀化痰饮,经临床应用疗效满意。方中选用泽泻、制半夏、海藻除水湿、消痰浊;丹参、郁金活血通络,祛肝经之瘀,增强肝脏血运;生大黄通腑导滞,降浊祛脂,与泽泻配用,分流疏导,使邪有去路;生山楂祛瘀消积;柴胡、决明子疏肝利胆,清肝经郁热;生黄芪、炒白术补气健脾,以助痰瘀的运除,而且也体现了 “见肝之病,当先实脾”的治疗法则。诸药合用则清降痰浊瘀积,调节肝脾功能,从而达到抗脂肪肝的目的。

高脂饮食所诱发的血浆低密度脂蛋白、甘油三酯和游离脂肪酸含量增高,以及伴随的高密度脂蛋白水平下降和肠源性内毒素血症,使肝脏枯否氏细胞聚集、增生和激活,枯否氏细胞可分泌 TNF-α、IL-1、IL-6等细胞因子,导致生物膜的损伤。研究表明,肝脏枯否氏细胞过量分泌 TNF-α、IL-6等因子是引起肝细胞坏死的重要介质。[2-4]TNF通过与细胞表面的 TNF受体结合而起作用,肝细胞的 TNF受体具有高亲和力、低容量等特点,故对低浓度的 TNF-α即可发生强烈反应,另外,TNF-α是脂蛋白酶的强力抑制剂,高浓度的 TNF-α可减少外周组织脂肪分解,并促进肝细胞甘油三酯的合成及聚集。TNF-α还可诱导IL-1、IL-6等细胞因子的产生,共同参与肝损害,另外还可引起中性粒细胞趋化,进而导致肝脏炎症反应,并通过脂质过氧化使细胞受损,最终导致肝细胞坏死。[5]

本项研究结果显示,采用高脂饮食复制的NAFLD动物模型大鼠,由于实验过程中长期大量进食高脂肪、高胆固醇饮食,游离脂肪酸 （FFA）被肝脏摄取量也随之增多而蓄积,FFA是具有高度细胞毒性的两性分子,FFA作用于肝细胞,可导致肝细胞线粒体肿胀和通透性增加、肝细胞变性、坏死和炎症细胞浸润,诱发非酒精性脂肪性肝炎,内毒素血症可激活肝细胞或/和枯否细胞,促使其分泌 TNF-α、IL-6等细胞因子,导致生物膜的损伤。经药物干预后,治疗各组血 TNF-α和 IL-6的含量均低于模型组 （P＜0.05或 P＜0.01）;高、低剂量组低于阳性药对照组 （P＜0.05）;而高、低剂量组之间和 TNF-α和 IL-6的含量未见明显差异 （P＞0.05）,说明各用药组均有抑制枯否细胞过度活化、降低血清 TNF-α和 IL-6的含量,减少炎性细胞浸润的作用,而消瘀化痰方的保护肝脏作用优于阳性对照药。

综上所述,经动物实验证实,TNF-α和 IL-6在NAFLD的发生、发展中起着重要作用,TNF-α和 IL-6合成与释放过多介导了肝损伤的发病过程。因此,检测血清中血清 TNF-α和 IL-6的含量高低可以作为 NAFLD临床诊断的重要参考指标之一。另外,消瘀化痰方可显著降低血清血清 TNF-α和 IL-6含量,防止其对肝脏的进一步损害,此可作为消瘀化痰方治疗NAFLD的作用机制之一。

[1] 苗卉,魏翠萍,张一盺,等.消瘀化痰饮对非酒精性脂肪肝大鼠脂质代谢和肝组织形态学的影响 [J].河北中医药报,2007,22（2）:3-5

[2] 陈贤明,马学惠,许瑞龄,等.酒精刺激对枯否氏细胞清除LPS功能的影响 [J].中国病理生理杂志,1998,14（4）:389

[3] 任红,张定风,贾小平,等.病毒性肝炎肿瘤坏死因子和白细胞介素 6的研究 [J].中华医学杂志,1989,5（3）:264

[4]McClain CJ,Barve S,Dohn L,et al.Cytokines in alcoholic liver disease[J].Semin Liver Dis,1999,19:205

[5] 范建高,曾民德.脂肪肝 [M].上海:上海医科大学出版社,2000.69

（2009-12-30 收稿）