桑 丹 孙海洲* 赵存发 郭俊清

（1.内蒙古农牧业科学院动物营养研究所,呼和浩特 010030;2.内蒙古农牧业科学院,呼和浩特 010031; 3.内蒙古农业大学动物科学与医学学院,呼和浩特 010018）

畜牧生产的目的是提供肉、蛋、奶等畜产品,以满足人类对蛋白质的需求。如何提高动物机体蛋白质合成量和饲料中蛋白质的利用效率,为人类提供更加安全、健康的食品,是近年来反刍动物蛋白质营养研究,特别是分子营养学兴起以来的热点和焦点。近年来,随着氨基酸营养组学的兴起,研究者们提出了功能性氨基酸的概念。功能性氨基酸是指除了合成蛋白质外还具有其他特殊功能的氨基酸,其不仅对动物的正常生长及维持是必需的,而且对多种生物活性物质的合成也是必需的。此类氨基酸包括精氨酸、谷氨酰胺、支链氨基酸（branched-chain am ino acids,BCAAs）、色氨酸、甘氨酸和脯氨酸等[1]。BCAAs包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸,是唯一一类调控肝外代谢的必需氨基酸。它们主要在骨骼肌代谢,约占骨骼肌蛋白质必需氨基酸的35%,同骨骼肌的合成有着密切的关系[2]。早期研究表明BCAAs在调节骨骼肌中蛋白质合成具有重要作用[3]。亮氨酸是动物体内唯一的生酮氨基酸,它是BCAAs中对蛋白质代谢起主要调节作用的氨基酸。近年来有研究进一步证实,BCAAs中的亮氨酸在刺激肌肉内部蛋白质合成是最有效的,而异亮氨酸和缬氨酸要差一些[4]。有研究报道,亮氨酸增加蛋白质合成高达50%,而抑制分解仅为25%[5]。抑制分解的主要是亮氨酸分解代谢产物α-酮异己酸的作用。

功能性氨基酸具有特殊的营养功能,补充功能性氨基酸在增强机体能量代谢、增强免疫能力、延迟中枢疲劳、促进肌肉合成、加快机体恢复等方面具有一定的功效。为此,本试验根据代谢动力学原理,结合常规动物营养学研究方法,采用大剂量一次性灌注法,从组织蛋白质周转入手,研究瘤胃保护性亮氨酸对绵羊机体蛋白质合成的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选用12只体况良好,体重为（25.00±2.86）kg的6月龄绵羊羯羊,按体重随机分为4组,每组3只,进行动物试验。

1.2 试验饲粮

试验基础饲粮参照肉羊饲养标准（NY/T 816—2004）配制,基础饲粮组成及营养水平见表1。对照组试羊（1组）饲喂基础饲粮,每只日喂量1.0 kg;试验组试羊每日每只分别补饲0.5（2组）、1.0（3组）和1.5 g（4组）瘤胃保护性亮氨酸。试验组每日基础饲粮饲喂量1.0 kg,补饲瘤胃保护性亮氨酸混入基础饲粮中喂给。试验期间各组试羊无剩料现象。瘤胃保护性亮氨酸添加量参考Flakoll等[6]。亮氨酸购自生工生物工程（上海）有限公司,纯度99%,包被产品来源于常州佳发制粒干燥设备有限公司。

表1 基础饲粮组成及营养水平（干物质基础）Tab le 1 Com position and nutrient levels of basal diet （DM basis,%）

1.3 饲养管理

试验羊每日在06:00和18:00分别先粗后精等量饲喂2次,自由饮水。预试期15 d,饲喂基础饲粮。试验期15 d,对照组饲喂基础饲粮,试验组饲喂添加瘤胃保护性亮氨酸的饲粮。

1.4 试验方法

本试验采用大剂量一次灌注法,测定不同组织的蛋白质合成率（FSR）[8]。

试验期结束后,在预先刮好的腹部皮肤处用普鲁卡因进行局部麻醉,用直径1 cm的环钻在该区域的后底缘采取2个皮肤组织样品,用作组织的本底样品（t0）。采下的样品用冰生理盐水冲洗,液氮冷冻,-80℃冷藏保存。通过绵羊一侧颈静脉插管将L-d5苯丙氨酸灌注液缓慢注入,10 m in注完。灌注剂量为按每kg BW0.75灌注0.2 gL-苯丙氨酸（L-Phe,其中含0.027 gL-d5苯丙氨酸,纯度99%）。

灌注前,从另一侧颈静脉插管采取血液样品作为0时间点样品。灌注开始后,分别在5（灌注中）、10（灌注后）、20、40、60及90m in采取血样,每次采血5～10 m L。在冰浴中保存,然后在4℃条件下2 000×g离心15 m in,血浆样品-20℃保存,供同位素Phe分析。在灌注开始后90m in,迅速放血屠宰。快速采取背最长肌、股二头肌、肝脏等组织样品,冷盐水冲洗,液氮冷冻,-80℃保存。准确记录组织样品的采样时间。准确记录肌肉、肝脏和皮肤等各组织的重量。经过前处理后[8],通过气-质联用仪（GC-MS）来测定各组织FSR及蛋白质合成量。

1.5 计算方法

1.5.1 血浆游离氨基酸库中示踪氨基酸的丰度（MPEp）的计算[8]

MPEp等于90m in采样期间各采样点MPE的加权平均值。M PE0,M PE5,…,M PE90分别代表0, 5,…,90m in的MPE值。

1.5.2 各组织FSR的计算

FSR的计算根据Lobley等[9]采用的公式计算:

MPE0和MPEt分别代表0时间点本底样品和90 m in采集样品中蛋白质结合的MPE值。

1.5.3 总蛋白质合成量的计算

总蛋白质合成量（g/d）=（蛋白质含量×FSR）/100

1.6 数据统计分析

试验数据利用Excel软件进行整理,运用SPSS 12.0统计软件进行One-way ANOVA分析,用Duncan氏法进行多重比较,P＜0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 瘤胃保护性亮氨酸对各组织FSR的影响

在本研究中,瘤胃保护性亮氨酸对骨骼肌FSR有显著影响（P＜0.05）。如表3所示,3组股二头肌FSR显著高于1、2和4组（P＜0.05）;各试验组背最长肌FSR与对照组比较差异显著（P＜0.05）。各试验组肝脏FSR与对照组比较差异均不显著（P＞0.05）。

表3 瘤胃保护性亮氨酸对绵羊机体蛋白质合成速率的影响Table 3 Effects of the rumen-protected leucine on fractional synthesis rates of protein in sheep（%/d）

2.2 瘤胃保护性亮氨酸对各组织蛋白质含量和合成量的影响

瘤胃保护性亮氨酸对各组织蛋白质含量的影响见表4。3组股二头肌蛋白质含量显著高于其他各组（P＜0.05）,其他各组之间差异不显著（P＞ 0.05）,以对照组蛋白质含量最低。3组背最长肌蛋白质含量显著高于1组和2组（P＜0.05）,4组背最长肌蛋白质含量与对照组比较显著提高（P＜0.05）。各组肝脏蛋白质含量差异不显著（P＞0.05）,其中以3组最高。

表4 瘤胃保护性亮氨酸对绵羊机体蛋白质含量的影响Table 4 Effects o f the rumen-p rotected leucine on p rotein content in sheep（g）

瘤胃保护性亮氨酸对股二头肌、背最长肌及肝脏的蛋白质合成量的影响见表5。各试验组股二头肌、背最长肌和肝脏的蛋白质合成量均显著高于对照组（P＜0.05）,3组股二头肌和背最长肌合成量显著高于其他各组（P＜0.05）

表5 瘤胃保护性亮氨酸对绵羊机体蛋白质合成量的影响Table 5 Effects of the rumen-protected leucine on synthesis content of protein in sheep（g/d）

3 讨 论

3.1 亮氨酸对骨骼肌蛋白质合成的影响

传统营养学研究是利用生长试验或氮平衡试验评定动物生产能力和饲粮中粗蛋白质的营养潜力,但是始终不能满意地解释粗蛋白质摄入变化对机体蛋白质沉淀过程变化的影响。体蛋白质的动态平衡概念提出以后,人们对营养素的中间代谢才有了比较深刻的认识。作为认识体蛋白质代谢的基本理论,蛋白质的动态平衡仍然是提高动物生产效率、提高饲料利用率、准确评定动物营养需要的重要研究领域[10]。

本试验从蛋白质周转入手,研究亮氨酸对绵羊机体蛋白质合成的影响。蛋白质周转受到诸如营养水平、激素、动物生理状态等多种因素的影响。蛋白质周转对饲粮的采食水平也非常敏感,而蛋白质的沉积主要与饲粮的蛋白质品质及能量摄入有关。很多研究是针对整体蛋白质周转代谢,而整体蛋白质周转代谢的改变并不意味着机体的所有组成部分都同样发生改变。

Fulks等[11]研究发现,同其他氨基酸相比,在离体培养的老鼠隔膜的介质里加入等同于其血清中浓度的BCAAs,包括亮氨酸、异亮氨酸与缬氨酸,可更有效地促进蛋白质的合成并抑制蛋白质的分解。而当加入介质里的BCAAs达到5倍于血清浓度（0.5 mmol/L亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸）时,会促进蛋白质的合成并抑制其降解。此后,Buse等[12-13]进一步研究发现,促进老鼠半隔膜蛋白质的合成并抑制蛋白质的降解的是亮氨酸而不是异亮氨酸或缬氨酸。Libby等[5]也研究表明,对蛋白质代谢具有调节作用的支链氨基酸主要是亮氨酸,而异亮氨酸和缬氨酸对体内蛋白质合成和降解影响甚小。亮氨酸可能通过其氧化脱羧反应中支链含氧酸脱氢酶活性形式的改变,降低蛋白质的降解[5]。Tischler等[14]和Li等[15]也分别证实了亮氨酸在骨骼肌蛋白质周转代谢中的这种作用。在本试验中,瘤胃保护性亮氨酸对骨骼肌FSR有显著影响,其对股二头肌、背最长肌的蛋白质合成量也都有显著影响,这与以上研究结果一致。

3.2 亮氨酸对肝脏蛋白质合成的影响

Libby等[5]认为,亮氨酸对肌肉中蛋白质平衡的生理调节作用类似胰岛素,但亮氨酸对蛋白质的调节作用仅限于肌肉组织,对肝脏和成纤维细胞则无此效应。Lobley等[16]研究表明,肝脏FSR对迅速变化的营养供应反映并不敏感,提高营养水平对肝脏FSR无明显影响,但随着营养水平的提高,肝脏的重量和蛋白质总量增加。由于FSR无变化,提高营养水平时蛋白质的沉积增加,肝脏体积增大有可能是蛋白质降解率下降的结果[17]。Häussinger等[18]研究表明,肝脏的蛋白质降解可能由肝脏细胞体积变化来调节,当营养素和代谢产物浓度和量发生变化时,影响了细胞内渗透压,进而使得肝脏细胞体积以及数量改变,肝重量和蛋白质总量也发生相应的变化。本研究中,各组肝脏蛋白质总量差异均不显著,可能因为机体可利用氨基酸数量相对较高,导致肝脏蛋白质的降解速率下降,从而造成肝脏重量和蛋白质总量的增加。

4 结 论

①瘤胃保护性亮氨酸对绵羊骨骼肌FSR的影响显著（P＜0.05）,但对肝脏FSR则影响不显著（P＞0.05）。

②瘤胃保护性亮氨酸对绵羊骨骼肌及肝脏组织的蛋白质合成量显著增加（P＜0.05）,以1.0 g/d添加量效果最好。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:sunhaizhou@china.com

（编辑 田艳明）