高 静 张 丽 侯 云 肖长杰 高德安

(泰山医学院附属泰山医院口腔科 ，山东 泰安 271000)

幽门螺杆菌 (helicobacter pylori，Hp)的传播途径至今尚未完全明了，但多数研究[1-2]的结果显示，在自然环境中人是唯一的传染源，人—人之间传播是唯一的传播途径，人—人之间的传播是通过口—口和胃—口传播，其根据是贮存在胃粘膜上的Hp随胃上皮细胞的脱落可存活在胃液中，通过胃—食道返流进入口腔，进而滞留在牙菌斑中，并通过唾液传播感染。此外口腔Hp在根除胃内Hp感染后仍然存在[3]，有可能是胃感染复发或再感染的主要原因。本研究目的在于分析胃病患者胃幽门螺杆菌与口腔幽门螺杆菌的基因型，以及同一家庭成员口腔幽门螺杆菌的基因型，以明确胃与口腔的Hp是否具有同源性，为证实口—口和胃—口传播途径提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病例选择 选择胃Hp阳性并伴菌斑Hp阳性患者(6人)的胃粘膜、菌斑样本共10份(胃粘膜4份，菌斑6份)。6例患者的胃镜和病理诊断分别为慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡。6人中有1人是胃Hp阳性患者家属，以进行该家属携带的Hp与患者Hp的基因同源性分析。

1.2 标本取样 所有患者的菌斑和唾液标本均在胃镜检查和活检前采集。菌斑取样：从每例患者口腔内选择有牙龈炎症的6颗牙作为取样牙。以棉球隔湿，吹干后分别用消毒刮匙刮取龈上、龈下菌斑。将取样标本置于含100 μl样本处理液的Eppendorf管内。胃粘膜取样：胃镜检查时从患者的胃窦部取3块活检组织，液氮速冻保存。

1.3 DNA提取及PCR检测Hp

1.3.1 提取DNA 标本悬浮于100 μl样本处理液中，56 ℃孵育30 min,高速震荡10 s后置100 ℃水浴8 min，再次高速震荡10 s，离心(12000 r/min,4 ℃)3 min。取上清用于PCR扩增。

1.3.2 PCR检测Hp 参考Bickley,Lage等的研究，引物根据尿素酶C基因和CagA基因进行设计。尿素酶C基因：引物1(UC1)5’-GCCAATAAATTAGTT-3’，引物2(UC2)5’-CTCCTTAATTGTTTTTAC-3’，扩增片段为294 bp；CagA基因：引物1为5’-AATACACCAACGCCTAG-3’，引物2为5’-TTATTGCCGCTTTTGCTCTC-3’，预期扩增片段为400 bp。20 μl反应体系内含有两对引物各20 pmol/L，每种寡核苷酸4 mmol/人，DNA模板4 μl ,Tag DNA 聚合酶2U及PCR缓冲液，反应在 PCR扩增仪(美国PE公司)上进行，94 ℃预变性5 min,94 ℃变性1 min，55℃退火1 min，72 ℃延伸2 min为一个循环，共计35循环，循环结束后72 ℃继续延伸7 min，以Hp标准菌株NCTC11637(中国预防科学院提供)的DNA提取液作阳性对照，采用PCR试剂盒内的阴性对照，用8%丙烯酰胺电泳鉴定PCR产物。每一位受检者12份牙菌斑中只要有1份Hp阳性，则该受检者口腔Hp检测结果统计为阳性。

1.4 胃粘膜PCR产物(尿素酶C基因)的直接测序 需测序的胃粘膜DNA标本的PCR扩增方法同1.3，重复扩增3～4管，然后合并扩增的PCR产物，加入溶液体积1/10的3M乙酸钠(pH5.2)及溶液体积3倍的无水乙醇，混匀后在-20℃冰箱中放置1 h以上，12000 r/min离心15 min，小心吸尽液体，加入20 μl TE缓冲液，上样于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳。在365 nm紫外灯下切下含DNA的凝脉。凝脉块中DNA的提取方法用二氧化硅微粒法提取，放在洗涤和干燥后的玻璃瓶中加入10 μl三蒸水。吸出的DNA溶液保存在-20 ℃，然后送宝生物技术公司用尿素酶C的正向引物作DNA测序。

1.5 菌斑尿素酶C PCR产物的直接测序 菌斑标本的尿素酶C PCR产物量较少，标本量有限，所以用刀片从银染后干燥的聚丙烯酰胺凝胶中切下阳性条带，放在1.5 ml Eppendorf管中，加入TE缓冲液30 μl，放置30 min，捣碎，再反复冻融及震荡3次，离心后吸取上清液2 μl作为PCR的DNA模板。然后按上述的方法提取测序用的DNA模板。

2 结 果

将同一患者不同部位或同一患者治疗前后胃粘膜或口腔PCR扩增产物，以及患者及家属的PCR扩增产物(尿素酶C基因)进行测序，并配对比较。结果用Clustal W 分析软件(http://www.ebil.ac.uk)分析。

2.1 患者1胃粘膜和牙菌斑PCR阳性产物测序的比较 患者1的最初病理诊断为胃溃疡。胃粘膜和牙菌斑PCR阳性产物的测序结果显示有两处碱基不同，一处胃粘膜Hp菌株的碱基T与其它菌株的测序结果不同，而菌斑的碱基则为T/C；另一处显示胃粘膜Hp的碱基与标准菌株相同，为T，而菌斑则为T/C。说明口腔中存在两种菌株的混合感染，一种可能与胃粘膜菌株相同，另一种则不同于胃粘膜菌株。该患者服药4周后再次复查胃Hp的感染状况，结果13C呼气试验为阳性。

2.2 患者2胃粘膜和牙菌斑PCR阳性产物的测序比较 患者2胃粘膜和菌斑PCR阳性产物的测序结果显示两处碱基不同。该患者服药4周后复查13C呼气试验为Hp阴性，1年后复查结果转为阳性。

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2.3 患者3胃粘膜和菌斑PCR阳性产物测序的比较 患者3胃粘膜和菌斑PCR扩增产物测序结果完全一致，此患者胃粘膜和口腔菌斑的两处碱基对完全一致。说明该患者胃粘膜和菌斑Hp菌株的基因型是相同的。该患者服药4周后复查13C呼气试验为Hp阴性，1年后复查结果转为阳性。

2.4 患者4胃粘膜与药物治疗后牙菌斑PCR阳性产物的测序比较 患者4胃粘膜与药物治疗4周后牙菌斑的PCR阳性产物的测序结果显示共三处碱基不同。药物治疗前此患者口腔未能检测到Hp，药物治疗4周后菌斑检测出Hp。该患者服药4周后复查13C呼气试验为Hp阳性，1年后复查结果仍为阳性。

2.5 患者与其家属牙菌斑PCR阳性产物的测序比较 测序结果显示两标本有两处碱基不同。该患者服药4周后复查13C呼气试验为Hp阳性，1年后复查结果仍为阳性。

3 讨 论

幽门螺杆菌是慢性胃炎和消化性溃疡的重要致病因子，并且与胃癌的发生密切相关[4-5]。Hp在人群中的感染率较高，全球多数地区Hp感染率在60%左右。我们前面的研究[6]结果显示，口腔是Hp在人体内的另一贮存地，同一患者胃内Hp与口腔Hp究竟是否为同一菌株，其基因型是否相同尚无定论。本研究旨在从分子生物学角度进一步检测胃Hp与口腔Hp的基因同源性，论证胃与口腔Hp的关系。

近年来，国外一些研究用PCR检测胃和口腔中的Hp。Oshowo[7]用PCR技术结合限制性内切酶比较分析了15名患者胃粘膜和菌斑中的Hp，发现其中13名患者两部位的菌株具有相同的酶切图谱，而其中4例菌斑、胃粘膜、十二指肠三处菌株的酶切图谱相同。Song等[8]从8位胃Hp阳性患者和12位胃Hp阴性患者的牙菌斑、含漱液和胃粘膜标本提取DNA后，用EHC-U/EHCH-L和ET5-U/ET5-L为引物进行N-PCR扩增，其口腔标本的个人检出率为100%。本研究对胃与口腔阳性标本的PCR扩增产物进行了DNA测序，结果显示同一患者牙齿菌斑中的Hp与胃粘膜Hp有97%以上的同源性，表明口腔与胃Hp菌株的基因型基本相同或略有不同。本研究对4名患者口腔与胃Hp的PCR扩增产物进行了DNA测序，结果显示患者龈下菌斑与其本人的胃粘膜PCR扩增产物的测序结果相同或有1～3个碱基不同，说明胃与口腔Hp的基因同源性达到98%以上，口腔Hp与胃粘膜Hp可能来自同一菌株，或同一菌株发生个别变异。

有关Hp基因型变异的机制目前尚未明确，可能是Hp在人体长期进化的结果。不同的Hp菌株在其感染个体和他们的后代继续繁殖生存，在长期慢性的感染过程中，通过基因组的重组、突变、转化以及基因序列的改变而出现新的变异菌或亚群，以更好地适应宿主体内的环境，长期生存下去。另一方面Hp微小的基因型变异可能是因为长时间点突变的累积，或是不同菌株间的等位基因的转移所致。以往有关胃内不同部位或同一部位Hp的DNA分析显示，胃内不同部位或同一部位存在同一菌株的感染，但多数表现出个别碱基的差异，与本研究胃与口腔Hp的测序结果相类似。我们的研究证实口腔存在与胃内基因型相同的菌株，表明口腔与胃内可能为同一菌株的感染。而口腔Hp的基因型与胃Hp的基因型的微小差异则反映了菌株和宿主间的相互作用。

一些研究资料显示，胃癌高发区的国家和人群的幽门螺杆菌感染率也高，幽门螺杆菌感染率与胃癌死亡率呈明显的正相关。幽门螺杆菌不具备基因毒性，不会直接引起人体细胞DNA突变及细胞表型的转化，但幽门螺杆菌所分泌的大量氨和磷脂酶等可以破坏胃粘膜的保护机制，使各种具有致癌作用的因子直接作用于粘膜上皮细胞，同时幽门螺杆菌分泌的化学物质也可以直接促进细胞分裂，增加DNA突变的机会。

目前为止，大多数的研究认为Hp感染的传播途径可能为口—口传播。Song等[8]提取一位母亲含漱液和其孩子的菌斑标本DNA后，比较PCR扩增阳性产物(230 bp)的测序结果，发现两者的DNA序列完全相同，表明Hp可能通过口—口途径传播给儿童，这种传播途径与链球菌的传播途径相似。我们的研究结果显示，Hp感染患者与共同生活的家属的菌斑PCR扩增产物仅有3个碱基的差异，可能是来自同一菌株的变异菌或亚群，家属口腔中的Hp可能为胃Hp感染复发或再感染的隐患因素。且患者家属并没有胃Hp感染表现，而患者本人服药4周后复查13C呼气试验为Hp阳性，1年后复查结果仍为阳性，推测口腔Hp可能是胃内Hp感染的贮存地，患者及其家属之间密切接触和共同的生活习惯可能互相感染Hp，使患者具有胃Hp再感染或感染复发的可能性，为口—口传播假设提供依据。

本研究对胃粘膜与口腔Hp的测序结果比较进一步说明同一个体口腔Hp与胃内Hp可能来源于同一菌株，口腔Hp是胃内Hp感染的重要病原因素。同一家庭成员的口腔Hp测序结果尚未见报告。本研究例数较少，但结果显示患者口腔菌斑与其本人的胃粘膜PCR扩增产物的测序结果为基本型相同或有1～3个碱基不同，基因同源性达到98%以上，说明口腔Hp与胃粘膜Hp基因型相同或基本相同，不同部位的Hp可能来自同一菌株，或同一菌株发生个别变异。

口腔是Hp的重要聚集地，口腔Hp可能是胃复发或再感染的潜在因素。口腔Hp与胃内Hp可能为同源菌株，但口腔内的Hp如何定植于胃内以及Hp的再感染或复发的菌株是否与其本人口腔中的Hp为同一菌株等尚需进一步研究。总之本研究可以为今后胃与口腔Hp关系的研究提供一定的理论依据。

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