方 涛,初向阳

(解放军总医院胸外科,北京,100853)

根据WHO统计,肺癌已经成为全球男性和女性的第一癌症杀手,造成了沉重的社会负担。肺癌也是我国发病率最高的癌症,年发病率为35/10万人。早期肺癌往往缺乏明显症状,60%～85%非小细胞肺癌患者无法进行根治性切除,使用常规化疗只能略微改善症状而无法获得长期疗效。吉非替尼(Gefitinib)起初作为表皮生长因子受体(EGFR)阻滞剂用于化疗难治性非小细胞肺癌(NSCLC)患者的姑息治疗,它对一小部分NSCLC患者有快速、显著的疗效。进一步研究发现,这些患者绝大部分存在内皮生长因子(EGF)基因突变[1]。有关EGFR突变与肿瘤发生以及EGFR突变在分子靶向治疗中的作用日益受到人们的关注。现就EGFR突变在肺癌发生中的分子机制及分子靶向治疗的临床研究近况进行介绍。

1 内皮生长因子受体(EGFR)

内皮生长因子受体(EGFR)是一种蛋白酪氨酸激酶受体(RTK),位于第7号染色体p13～q22区,全长200 kb,由28个外显子组成,编码1186个氨基酸[2],其糖蛋白分子量约l70 kDa[3],广泛分布于除成熟骨骼肌细胞、体壁内胚层和造血组织以外的所有组织细胞。EGFR家族有4个结构相似的受体分子:ErbB1(EGFR)、ErbB2(HER2)、ErbB3(HER3)、ErbB4(HER4),同属于受体酪氨酸激酶(RTKS)。它们都含有1个胞外配体结合结构域,1个跨膜结构域和1个具有酪氨酸激酶活性的胞浆结构域。其胞内区域与erbB癌基因产物高度同源[4]。

EGFR的活化可以通过配体诱导的受体二聚化作用实现。ErbB受体家族中,除了HER2外,其他成员都有其相应配体,各种各样的配体是由对应的跨膜蛋白前体经过蛋白水解而来的,都有1个EGF样结构域。与EGFR特异性结合的配体包括表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、双向调节蛋白(AR)、β-细胞素(BTC)、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)、表皮调节素(EPR)等[5]。

胞外配体EGF(内皮生长因子)与ErbB2特异性结合后引起ErbB2构型改变,导致受体二聚化从而活化它们的胞浆位点。ErbB2的胞内区域酪氨酸磷酸化后进而活化第二信使转导,通过MAPK(丝裂原蛋白激酶)途径诱导细胞外信号的活化(调节激酶Erkl和 Erl):通过PDK(磷脂酰肌醇激酶)途径活化信号转导子JAK;进一步启动STAT1、STATS3的转录活化子;另一方面,细胞内信号通过Grb2(生长因子受体结合蛋白)活化下游的ERK(细胞外调节蛋白激酶),进而介导ATF,NF-κ B,Ap-1,c-fos和 c-Jun的转录活化。这些都是EGFR所介导的生长作用或致癌的基本下游途径。

异常的EGFR活化机制包括受体本身的扩增、受体配体的过表达、活化突变以及负性调节途径的缺乏,因此EGFR诱导癌症至少通过3种机制:EGFR配体的过表达,EGFR的扩增或EGFR的突变活化[6]。在这3种机制中,EGFR的突变活化是导致肿瘤细胞异常生物学行为的最主要因素。

EGFR基因的某些突变会导致受体效果增强和持续时间的延长。Lynch等证明变异受体并不影响受体蛋白质的稳定性,通过Tyr1068磷酸化测定EGFR活化发现,野生型受体的活化15 min即下调,而变异受体表现出比正常EGFR高2倍的效应,且超过3 h的持续活化[7]。

2 EGFR突变与TKI的治疗效果

EGFR突变并没有影响肿瘤细胞与TKI(酪氨酸激酶抑制剂)结合的能力。TKI对那些因突变而导致EGFR活化的原因可以通过oncogene addiction模型来解释。通过 Ras.Raf-MEK.ERK1/ERK2、PI3K.Akt、STAT3/STAT5 通路,EGFR突变高度激活下游信号,启动EGFR调节抗凋亡和生存信号,导致癌症细胞变得依赖此信号以维持其生存——即具有癌基因(突变的EGFR)依赖的特征;当使用特异性 TKI阻断EGFR信号后,将消除其增殖性影响和输出生存信号,导致肿瘤细胞死亡。因此认为,癌症细胞中信号转导通路的变异是出现药物高敏感的基础。相反,正常细胞或非EGFR依赖的肿瘤细胞(对Gefitinib、Erlotinib无反应)不受影响。因为生存还受其他基因驱使,或者在EGFR抑制后能被其他的RTK所弥补。

在癌基因依赖模型中,细胞癌症依赖的癌基因可以同时产生凋亡和生存2个信号的输出。一般情况下,癌基因被激活。生存信号占主导地位,而凋亡信号处于相对低水平,使癌症细胞维持生长和增殖。当癌基因急性失活后,在关键的窗口期,首先是生存迅速大幅度减弱。而凋亡信号缓慢下降。因此导致信号不平衡(凋亡信号占主导),启动细胞发生不可逆的凋亡[8]。

研究发现用酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼(gefitinib)/厄洛替尼(Erlotinib)治疗NSCLC患者,大约 10%患者表现出迅速而满意的临床效果,进一步研究发现这些患者绝大部分存在EGFR基因突变。在目前已知与 EGFR-TKI(内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂)有关的基因突变局限于如下几种:G719X(18外显子),E746-A450缺失(19外显子),L858R(21外显子),L861Q(21外显子),T790M(20外显子)和D770-N771(20外显子)。其中E746-A450缺失和L858R的突变与TKI的疗效高度相关。

Mitsudomi T,Yatabe Y对568例非小细胞肺癌患者的分析结果:在所有非小细胞肺癌患者中大约90%的EGFR基因突变集中于19或21外显子中,其中19外显子的缺失突变及21外显子中的点突变的患者服用EGFR-TKI的有效率均达到70%以上[9]。

近来的研究提示,EGFR外显子20的插入性突变(D770-N771)可以使受体对 EGFRTKI的敏感性降低100倍,临床上也发现具有此突变的患者对EGFR-TKI治疗反应不明显[10]。

对外显子20的扩增产物进行亚克隆分析发现,T790M突变是一个碱基对发生从胞嘧啶核苷(C)到胸腺嘧啶核苷(T)的改变,在蛋白水平就是EGFR酪氨酸激酶功能域790位点的苏氨酸被蛋氨酸取代(T790M),这种突变可使EGFR重新处于被激活状态,从而导致TKI的获得性耐药,耐药的原因是突变导致EGFR结构发生变化,使TKI与其结合出现位阻效应[11]。为了进一步证实第二种突变导致患者对Gefitinib耐药,Kobayashi S等进行了体外试验,研究者将构建的T790M突变片断转染到体外培养的肿瘤细胞中,用不同浓度的Gefitinib(从0～2 mol/L)处理转染的细胞,然后采用Western-blotting方法,检测磷酸化EGFR的表达情况。结果证实发生T790M突变的细胞对Gefitinib耐药[12]。

KRAS是EGFR下游的关键调节分子。15%-30%的NSCLC存在KRAS密码子12和13突变,与患者的预后差相关。有研究提示KRAS突变可能是Gefitinib、Erlotinib原发耐药的原因。Helena linardou的Meta分析中总结了1008例NSCLC患者的TKI治疗效果,在发生K-ras突变的165名患者中,94%的患者对TKI治疗无明显反应[13]。

一般来讲,KRAS和 EGFR突变NSCLC是相互排斥的.在不同的肿瘤亚型中存在明显差异:EGFR突变主要见于不吸烟者,而KRAS突变更常见于吸烟相关的癌症。因为KRAS突变总是发生于具有野生型EGFR的NSCLC中,所以难以区分对EGFR—TKI不敏感到底是因为KRAS突变,还是因为无EGFR突变。

3 EGFR突变与临床相关因素

目前的研究表明EGFR突变与性别、种族、吸烟、病理类型有关,在东方人群、女性、非吸烟、腺癌的患者中变异发生率较高[14-16]。

Haneda研究了112例手术治疗的腺癌患者,年龄范围为38～82岁,平均年龄64.3岁,包括70名男性和42名女性,其中男性中非吸烟者49名(44%),吸烟者11名(15%),女性中非吸烟者38名(90%),在112例患者中发现发现48例患者病理为腺癌合并细支气管肺泡癌成分(包括腺癌合并细支气管肺泡癌成分和细支气管肺泡癌),其中28例存在EGFR突变,其他的64例患者中有24例存在EGFR突变,统计学分析表明EGFR突变与腺癌合并细支气管肺泡癌成分相关(P=0.0358)。Haneda还分析了性别和吸烟的影响,认为在病理类型为腺癌合并细支气管肺泡癌成分的男性患者中具有较高的EGFR突变率(P=0.0135),就整个患者群体而言,非吸烟患者较吸烟患者有较高的EGFR突变率(P=0.001),但在女性人群中,是否吸烟与EGFR突变无明显关联(P=0.999)[17]。

Yano[18]观察了32名具有EGFR突变的腺癌患者与48例无EGFR突变的患者的薄层扫描CT对比,分析了肿瘤直径、毛玻璃征比例、胸膜切迹、边缘毛刺、血管聚集与EGFR突变的关系,发现在女性患者中,肿瘤直径<3 cm,毛玻璃征比例>50%,有较高的EGFR突变率(11/12),但由于病例数少,尚有待证实。

Haneda[19]收集了95例直径小于2 cm的周围型腺癌标本,将标本分为2组,一组以肿瘤生长取代正常的肺泡细胞并有不同程度的肺纤维化为病理特征,另一组为肺泡细胞正常生长,没有破坏性生长,发现在前者(47.1%)中较后者中(16%)更易发现EGFR突变。

综上所述,东方人群、女性、非吸烟、腺癌与EGFR突变相关,在近期研究发现腺癌中含细支气管肺泡癌成分、肿瘤直径、影像表现毛玻璃征等也可以作为存在EGFR突变的依据。

4 EGFR的检测方法

4.1 DNA测序法

基因测序是检测基因突变的标准与可靠的方法。但过程较复杂:获取肿瘤组织、分离肿瘤细胞、提取核酸和进行测序,所需时间长,费用高,对取材和技术要求都比较严格,因此应用于临床仍受到一定程度的限制。在中国有基因公司专门提供EGFR基因突变的检测,尽管避免了操作的限制和缩短了成果的时间,但费用昂贵。

4.2 PCR-酶切法

PCR(聚合酶链式反应)是进行核酸扩增的有效方法。该方法基于已知的突变类型设计相应的引物,然后根据PCR产物的性质(有无或大小)来判断特异性突变的存在。该方法分为两步进行,首先利用限制性内切酶去选择性消化野生型的EGFR基因片断,从而使反应体系中突变型EGFR基因片断得到富集,再通过PCR放大和凝胶电泳来进行突变的判断。该法降低了对检测组织的要求,大大地提高了突变检测的灵敏度。PCR-酶切法无需测序,但只能针对已知的突变位点设计特异引物进行检测[20]。

4.3 PCR-SSCP

PCR-SSCP(聚合酶链式反应一单链构象多态性)是一种经典的检测基因突变的方法,原理为:单链DNA由于有链内碱基配对而具有一定的空间构象,当DNA链上的碱基发生改变时,单链DNA会形成不同的构象,即单链构象多态性。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中,不同构象的DNA分子具有不同的泳动速度。单链DNA分子的相对迁移率不仅与DNA分子的大小有关,而且与其构象有关。与测序法比较,该方法敏感性高,可以发现测序未能发现的突变。但PCRSSCP也有它固有的局限性,电泳时间较长,操作步骤比较繁琐,且只能进行定性的分析。

4.4 ScorpionsARMS

Scorpions ARMS(蝎形探针扩增阻滞突变系统)使用荧光标记的Scorpion引物进行PCR Scorpion引物含有一个特殊的探针序列,5′和3′端由互补的序列形成一个发夹环结构,从而在不同的扩增位点中止复制。大量终止于不同扩增位点的荧光引物经过电泳和分析后可以快速的得出结论。与直接测序法相比,ARMS法特异性接近,而敏感性更高,但该方法尚未获得批准进入临床,目前仅有少数研究机构可以进行。

综观以上所有方法,目前直接测序法仍是突变检测的金标准。相对于DNA测序法,其它分子生物学方法各有其优缺点,临床上亟待一种简便、快速、准确和经济的肺癌EGFR基因突变检测方法的出现,为肺癌个体化治疗服务,为肺癌病人造福。笔者认为ARMS法进入临床后会有较好的应用前景。

5 近期大规模临床试验结果

5.1 IPASS实验

IPASS(Iressa Pan-Asia Study):一项评价吉非替尼(易瑞沙)(250 mg片剂)对比卡铂紫杉醇双药化疗一线治疗临床选择的亚洲晚期(ⅢB或Ⅳ期)非小细胞肺癌(NSCLC)的疗效、安全性和耐受性的开放、随机、平行、多中心、Ⅲ期临床研究。

对于有EGFR突变的患者,吉非替尼组的PFS明显优于化疗组,相反,对于没有EGFR突变的患者,化疗组的PFS明显优于吉非替尼组;从有效率上看,没有EGFR突变的患者接受吉非替尼治疗的有效率竟然低至1.1%,不仅低于有EGFR突变患者接受吉非替尼治疗的71.2%,也显著低于化疗组的47.3%和23.5%。

结果表明:只有选择 EGFR基因突变的患者,行一线吉非替尼靶向治疗,才可能实现真正的个体化治疗;若对患者不加选择地使用EGFR-TKI,则EGFR突变阴性的患者生存期明显缩短。

5.2 SATURN实验

Cappuzzo报告的SATURN研究的数据,1949例晚期NSCLC患者接受了含铂两药化疗方案;889例患者在治疗后疾病无进展。收集这些患者的肿瘤组织,并根据EGFR表达、分期(ⅢB、Ⅳ期)、PS评分、化疗方案和吸烟史进行分层。患者随机分配至厄洛替尼组或安慰剂组接受治疗,直至疾病进展。

厄洛替尼组的PFS率显著高于安慰剂组(HR=0.71,95%CI 0.62～0.82,P=0.000003),而免疫组化EGFR阳性患者中该HR为0.69,其疾病进展风险降低29%～31%,PFS延长41%～45%。厄洛替尼治疗的有效率为40.8%,而安慰剂组仅为27.4%(P<0.0001)。

厄洛替尼组的毒性反应较小,患者可耐受。且亚组分析显示,对于各人群(无论性别、PS评分、EGFR表达和种族),厄洛替尼均显示有效。

5.3 META分析

Shepherd等对 INTEREST、V-15-32、SIGN和ISTANA这4项研究中的2257例患者进行了Meta分析,分析显示吉非替尼治疗者的OS和PFS与多西他赛治疗者相似,而ORR优于后者;在亚裔人群中,两组的OS相似,但PFS(P<0.05)和ORR(P<0.001)均优于多西他赛组。研究者认为,与多西他赛相比,吉非替尼疗效略佳,毒副反应小,患者生活质量(QOL)较高,且其口服方便,因此,无论亚裔抑或广泛人群都可能从中获益。

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