胡文滨

(石药集团高科医药科技开发有限公司,河北石家庄 052160)

无菌产品细菌内毒素的控制

胡文滨

(石药集团高科医药科技开发有限公司,河北石家庄 052160)

论述了细菌内毒素的有关问题,以及与热原,细菌的关系,并结合无菌原料药生产企业中无菌室的实际情况,分析了产生细菌内毒素的关键点,提出了如何去除细菌内毒素,为无菌车间注射级产品细菌内毒素的管理提供了思路方法。

细菌内毒素;热原;细菌;

1 细菌内毒素

细菌内毒素,英文称作 Endotoxin,是革兰氏阴性菌(G-菌)细胞壁个层上的特有结构,内毒素的主要化学成分为脂多糖中的类脂A,内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来,所以叫做内毒素。

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)由多糖 O抗原、核心多糖和类脂A(lipid A)组成,位于最外层。多糖O抗原向外,由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链,即革兰氏阴性菌的菌体抗原(O抗原),有特异性。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱 氧 辛 酸 (2-keto-3-deoxyoctonic acid, KDO)等组成,所有革兰氏阴性细菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄胺二糖为单位,通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物,具有致热作用,是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。

内毒素的致病机理:主要是由于革兰氏阴性菌和其它微生物(病毒、立克次氏体、衣原体螺旋体等)感染时,这类菌属随病灶渗液进入血液循环,并扩散到各种组织器官和体液细胞内繁殖,这类菌属在体内死亡和解体后,才稀放出大量的细菌内毒素脂多糖(LPS),这些因子刺激体温调节中枢导致机体发热。

1.1 细菌,革兰氏阳性菌(G+菌)和革兰氏阴性菌(G-菌)

细菌英文叫Bacteria,人们通常所说的即为狭义的细菌,狭义的细菌为原核微生物的一类,是一类形状细短,结构简单,多以二分裂方式进行繁殖的原核生物,是在自然界分布最广、个体数量最多的有机体,是大自然物质循环的主要参与者。

自然界存在多种多样病菌,如何将这些病菌加以鉴别、分类,并选择有效药物进行治疗这是很重要的问题。革兰氏染色法的意义就在于鉴别细菌,把众多的细菌分为两大类,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。常见的革兰氏阳性菌有:葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等;常见的革兰氏阴性菌有痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌、霍乱弧菌及脑膜炎双球菌等。

1.2 热原

热原系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。这里所指的“热原”,主要是指细菌性热原,是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。

热原具耐热性、滤过性、水溶性、不挥发性。热原最主要特性为耐热性,其为由磷脂、脂多糖和蛋白质所组成的复合物,存在于细菌的细胞和固体膜之间。脂多糖是内毒素的主要成分,具很强的热原活性。热原分子量越大致热作用也越强。

注入人体的注射剂中含有热原量达1μg/kg就可引起不良反应,发热反应通常在注入1小时后出现,可使人体产生发冷、寒颤、发热、出汗、恶心、呕吐等症状,有时体温可升至40℃以上,严重者甚至昏迷、虚脱,如不及时抢救,可危及生命。该现象称为“热原反应”。

《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法,细菌内毒素检查采用鲎试剂法。

1.3 热原和细菌内毒素的关系

热原的结构成分,目前国内外仍未有统一的认识,但从国内外文献报道中,一个共同的意见,都普遍认为:它是指细菌内毒素的脂多糖。

欧洲药典委员会副主席J.Van Noordw ijk提出:“严格地讲,不是每一种热原都具有脂多糖的结构,但所有已知的细菌内毒素脂多糖都有热原活性”。

细菌内毒素与热原相关,内毒素是药品热原检查不合格的主要原因。在 GM P条件下,药品生产的质量控制一般可以接受的观点是:无内毒素即无热原,控制内毒素就是控制热原,这也是药典普遍采用细菌内毒素检查法代替热原检查法的依据。

细菌内毒素检查法因其灵敏、准确、快速和经济等优点,越来越多被用于控制药品注射剂质量。

1.4 细菌内毒素和细菌外毒素

一般细菌毒素可分为两类,一类为外毒素(Exotoxin),它是一种毒性蛋白质,是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。

另一类为内毒素,是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构。内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。

1.5 细菌内毒素的计量单位EU

目前国际公认细菌内毒素量值 EU,一般来说1EU大致等于0.1～0.2ng。

关于细菌内毒素的量值在以前几乎都是以重量单位来表示它很不科学,相同重量的内毒素,由于菌株来源不同,提取方法各异而且所加附形剂不同,其生物活性相差很大。如EC-2和EC-5,其重量换算单位分别:5EU/ng和10EU/ng,随着人们对内毒素生物活性认识的不断提高,以效价单位表示内毒素的量值是十分合理的。

1.6 细菌内毒素的检测

细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁成分,当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。因此,细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中含内毒素的量为1至100EU/m l。当内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害,但内毒素通过注射等方式进入血液时则会引起不同的疾病。内毒素小量入血后被肝脏枯否细胞灭活,不造成机体损害。

内毒素大量进入血液就会引起发热反应—“热原反应”。因此,生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器材类(如一次性注射器,植入性生物材料)必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。

1956年美国人Bang发现美洲鲎血液遇革兰氏阴性菌时会产生凝胶。其后Levin和Bang发现微量革兰氏阴性菌内毒素也可以引起凝胶反应,从而创立了鲎试剂检测法。由于鲎试剂法简单﹑快速﹑灵敏﹑准确,目前已广泛用于临床、制药工业药品检验等方面。

在美国,鲎试验被称作为细菌内毒素试验(Bacterial Endotoxin Test)收载于1980年20版美国药典。随后英、德、意、日以及中国相继在药典中收载了这一检查法。此后鲎试验逐渐替代家兔热原试验。

2 细菌内毒素的去除

细菌内毒素的去除主要有:(1)高温法(2)酸碱法(3)吸附法(4)离子交换法(5)凝胶过滤法(6)反渗透法(7)超滤法。

内毒素不是蛋白质,因此非常耐热。在100℃的高温下加热1h也不会被破坏,只有在160℃的温度下加热2-4h,或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸30min才能破坏它的生物活性。

在无菌原料药生产企业中主要采用干热灭菌和湿热灭菌去除细菌内毒素,原料药液采用活性炭吸附法。主要采用中

活性炭对热原有较强的吸附作用,且有助滤脱色作用,在注射液生产中被广泛使用,但使用时用量一定要视原料质量、药液澄明度和其本身质量而定,一般为溶液总量的0.1%～1%。活性炭是去除热原的一种有效手段,但是在使用中要根据不同的情况确定其使用方式。

3 原料药生产企业无菌生产车间去除细菌内毒素的方法

在无菌原料药生产企业中,大致有结晶法,冻干法生产各种无菌原料药。生产青霉素,头孢类无菌原料药多采用共沸结晶,溶媒结晶法,无菌室中的设备主要有结晶罐,抽滤,离心或是罐式三合一进行固液分离,然后采用双锥,罐式三合一或是单锥干燥,手工分装或是自动分装的成品。

部分头孢,氨苄西林,羟丙基-β-环糊精等以水为介质采用冻干法生产无菌原料药。

3.1 结晶法无菌室控制细菌内毒素的方法

3.1.1 原材料检验(以头孢类为例)

主要原材料头孢××酸是细菌内毒素的携带者,主要原因有可能是合成头孢的重要原料媒法生产7-ACA过程中带入的。另一个需要及时监控的是注射用水,纯化水虽不控细菌内毒素指标,但要定期进行检测作为参考数据进行记录。检测指标要符合客户要求的指标。

3.1.2 生产过程控制

(1)有些品种生产时溶配时所用注射用水使用电子秤称量,未走管道,有被污染的可能性。

(2)溶配罐在上一批次投料完成后,料液压进无菌室后进行清洗,清洗后要干燥罐内,防止潮湿的环境滋生细菌。在长时间不使用后使用前检测细菌内毒素。

(3)过滤系统的滤芯的灭菌。滤芯在使用前要进行湿热灭菌,以除去细菌内毒素。从湿热灭菌柜中拿出到过滤器安装点路途远,注意保护,否则易被污染。

(4)过滤系统的清洗。过滤器的滤壳应使用5%的碱液处理。滤芯安装应注意防护,如穿洁净服,带手套等。

(5)过滤系统的清洗。在一个批次的料液压进无菌室后,要对滤芯使用注射用水进行清洗,一般从溶配罐接水经过过滤器进入到无菌室的设备中。要注意接到溶配罐中的注射用水没有被污染,同时是否使用80℃水直接洗。在清洗过程中注意滤芯材质,不要被破坏。洗过后应立即过下一批料,如果还有时间间隔,可以采用相应溶媒浸泡保护,直到过下一批料液。

(6)无菌室中结晶罐的清洗。在结晶完成一批料液后,使用注射用水进行清洗,清洗后要立即干燥罐内,直到接下一批次料液。如果等待下一批次料液时间较长,要定时间检测细菌内毒素。

(7)无菌室中过滤设备的清洗。在过滤完成一批料液后,使用注射用水进行清洗,清洗后要干燥设备,或是使用75%酒精淋洗,控干备用。

(8)无菌室中干燥设备的清洗。在干燥完成一批料后,使用注射用水进行清洗,清洗后要干燥设备,或是使用75%酒精淋洗,控干备用。

(9)无菌室中使用工器具的清洗。在完成分装操作后,使用注射用水进行清洗,清洗后要干燥设备,或是使用75%酒精淋洗,控干备用。

(10)衣服,眼镜,手指菌落,维修工具以及长时间放置在无菌室中的用具等物品要及时检测。长时间放置在无菌室中的出粉用眼镜,小维修或是拆卸工具,放置一段时间要及时检测。经常用水洗的物品器具要做定期检测,减少污染的可能性。

(11)经过湿热灭菌的物品如衣物,胶圈,西林瓶塞等注意保证灭菌时间,出湿热灭菌柜后的物品不应是湿的。

(12)无菌室中注射用水滤芯的检查清洗。有些无菌室中的注射用水没有直接与设备连接,而是采用U型弯后接一个过滤器,过滤后在接到设备上,目的是消除注射用水中的可见异物,但是这样一来,U型弯后到设备的一段管路成为了死水点,如不及时检测,清理,更换滤芯,易滋生细菌。

(13)一般无菌室的粗洗间纯化水,注射用水用水点放在一起,混用,水池子应及时清洗,检测。有些自动洗瓶机与注射用水U型弯连接管路较长,是一个死水点,使用前应放水清理。

(14)无菌室中现场卫生的保持。在结晶法的无菌室中有很多控制柜,开关,仪表线,防爆按钮,防爆电话等等,还会有很多溶媒管道,还有许多管道支撑件,钢平台,包了电机的不锈钢操作面,所以造成的死角很多,要及时清理,擦拭。

(15)无菌室中使用注射用水清理房间,地面卫生后定期检测细菌内毒素。

(16)进入无菌室中人员卫生保持。进入更衣室应洗澡,换衣。进入一更应洗脸,手,眼镜,鼻腔,口腔等部位,脱袜子后应洗脚,换鞋,避免带入灰尘,带入更多的细菌。

(17)纯化水检测细菌内毒素指标作为参考。要注意微生物限度数值的变化,如果微生物限度在消毒后好一些,逐渐高,可能系统有问题。

3.1.3 生产前清洗

生产线在生产前要使用5%的碱液洗涤设备管道,在安装好过滤系统,加料系统后,要采用纯蒸汽灭菌。确保设备,管路没有任何死角。

3.2 冻干法无菌室控制细菌内毒素的方法:

3.2.1 原材料检验

冻干法没有办法去除细菌内毒素,这就要求不带入更多的细菌内毒素,所以从源头控制非常关键。所用原料至少要符合客户要求的细菌内毒素指标。其他同结晶法。

3.2.2 生产过程控制

(1)冻干前往往完成成盐反应,所以前序的纯化水,注射用水中细菌内毒素指标非常关键,并注意不能被污染。

头孢类:在投料之前,溶解间的设备要用5%的碱液处理,之后冲洗至中性后立即使用,溶配罐在上一批次投料完成后,料液压进无菌室后进行清洗,清洗后要干燥罐内,防止潮湿的环境滋生细菌。在长时间不使用后使用前检测细菌内毒素。

羟丙基-β-环糊精:前期反应在12%左右的碱性环境中进行,后又经过酸碱树脂柱处理,所以前期不关键,关键点在进冻干机之前的浓缩,确保浓缩机使用前使用合适的试剂浸泡纳滤膜(长时间不使用不被染菌),然后就是快速进入冻干机冻干产品。之后浓缩机要立即进行清洗,洗净羟丙基-β-环糊精,减少细菌滋生的环境,若长时间不使用,要用合适的试剂浸泡纳滤膜。

(2)过滤系统的滤芯的灭菌。滤芯在使用前要进行湿热灭菌,以除去细菌内毒素。从湿热灭菌柜中拿出到过滤器安装点路途远,注意保护,否则易被污染。

(3)过滤系统的清洗。过滤器的滤壳应使用5%的碱处理。滤芯安装应注意防护,如穿洁净服,带手套等。

(4)过滤系统的清洗。在一个批次的料液压进无菌室后,要对滤芯使用注射用水进行清洗,在下一个批次料液过滤之前采用纯蒸汽走滤芯管道,对整个管道到加料枪进行蒸汽湿热灭菌处理。

(5)冻干机,冻干盘,无菌膜的处理。冻干机,不锈钢冻干盘可以采用5%的碱液处理,注射用水洗至中性控干后立即使用。现在冻干产品多使用无菌膜制作冻干盘冻干产品,减少了使用不锈钢冻干盘易造成金属屑的可见异物问题,但是,无菌膜进入无菌室一定要做好消毒,一般使用紫外灯,臭氧灯结合消毒,但要注意细菌内毒素是革兰氏阴性菌死后产生的,所以控制源头非常关键。

(6)冻干产品一般都要混粉,所以一般都配有混分器,所以,对混分器,磨粉,分装设备也要注意定期清理。

(7)其他同3.1章节的(9)～(17)。

3.2.3 生产前清洗

生产前清洗同3.1.3章节。

4 结论与讨论

(1)细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁个层上的特有结构,内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来,主要化学成分为脂多糖中的类脂A。在 GM P条件下,药品生产的质量控制一般可以接受的观点是:无内毒素即无热原,控制内毒素就是控制热原。

(2)内毒素跟无菌是两个概念,但稍有联系。无菌不合格,不一定内毒素不合格。原料药(如羟丙基-β-环糊精)有注射级这一说法,也就是指没有无菌的要求,但是有细菌内毒素的要求,用于生产最终灭菌的产品。但是无菌合格的产品也可能含有热原。

(3)生产过程中从源头开始的每一步控制细菌内毒素非常关键,0.22μm过滤可以除菌不可以除细菌内毒素。控制细菌内毒素要从源头控制,到最后的无菌室是不能根本解决的。

(4)制剂或者原料药除热原最常规工艺就是过炭,活性炭是去除细菌内毒素的有效方法,但是活性炭是否可以完全除去热原,没有任何报道说绝对可以。同时由于活性炭成分复杂,也会带入到成品中,所以活性炭可以防止并除去热原,主要是原辅料、水、容器中不要带入热原,从源头上尽量减少热原带入的可能性。

热原一般用活性炭吸附除去,常温,高温需要根据所生产产品而定,如果不适合用炭吸附,可用分子过滤(超滤)。

(5)超滤(U ltra Filtration缩写UF),超滤的孔径在0.001-0.05μm。主要分离对象是水体中的胶体物质、大分子物质(如蛋白质)、细菌、病毒等微生物。对于分子量小于1000的样品都可以使用超滤法来除内毒素,不过药物有损失。超滤虽然可行,但对分子大小及溶液粘度有较大的选择性。注意要对膜进行试验几次,密理博和PALL公司生产的膜虽说标称的分子量相同,但有时试验的结果却差很远。

A brief analysisabout how to control endotoxin of sterile product

(CSPC Shijiazhuang Gaoke M edical Technology Development Co.L td,Shijiazhuang Hebei052160,China)

The thesis discusses the relevant issues of the endotoxin,and its relationship w ith the pyrogen and bacteria.Based on the specific conditions in the sterile room of asep tic active pharmaceutical ingredient,analyze the key points of endotoxin generation,endotoxin elimination methods,and p rovide the suggestions fo r the management of endotoxin in the injection p roducts of the asep tic manufacturing facility.

Endotoxin;Bacteria;Pyrogen

HUWen-bin

R954

:A

1001-9383(2010)04-0057-05

2010-07-20

胡文滨(1969-),男,河北怀安人,工程师,主要从事抗生素产品研发工作.